棉花黄萎病(Verticillium Wilt of cotton)是一种土传、维管束系统性病害,被称为“棉花癌症”,给棉花的产量和棉纤维的质量都造成很大影响,其致病菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。由于大丽轮枝菌极易产生新的生理小种,给研究带来相当大的难度和很多的不确定性,因此对大丽轮枝菌的研究一直以来都是热点。本实验室利用寄主诱导的基因沉默技术(Host-induced gene silencing),以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料,构建一系列针对大丽轮枝菌靶标基因的烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)干扰载体,通过植物体内dsRNA与靶标基因互作,并进行统计病情指数统计,从中筛选出20个与病原菌生长发育与致病性相关的基因。本文从中选择腺苷酸激酶(adenylate kinase, AK)和寡糖基转移酶STT3亚基(oligosaccharyl transferase STT3 subunit, OST STT3)进行深入研究,期望进一步研究病原菌基因生物学功能和拓宽植物抗逆基因数据库。本研究的主要结果如下：1、利用实验室构建的HIGS体系,扩大本氏烟草培养规模,用含有AK和STT-3靶标基因片段的农杆菌注射植株10天后,接种106个/mL大丽轮枝菌,统计植株病情指数,并利用qRT-PCR进行植株真菌生物量检测和靶标基因表达水平分析；2、利用融合PCR技术,将靶标基因上、下游片段以及潮霉素抗性表达盒整合成一个完整的片段,通过BP反应将其构建至缺失突变体载体中；通过酶切反应,将新霉素抗性表达盒以及靶标基因表达盒构建至pCAMBIA1302载体中,成为回补质粒；然后将回补质粒中的靶标基因开放阅读框替换为GFP基因开放阅读框,成为GFP表达质粒。最后,通过农杆菌介导的方法获得阳性转化子。3、将野生型、突变体以及回补体孢子接种本氏烟草,统计植株病情指数并进行生物量测定,分析不同菌株毒力水平。同时,用表达GFP的野生型以及缺失突变体孢子接种本氏烟草,然后通过共聚焦显微镜观察两者在植株根部侵染的区别,旨在进一步明确靶标基因在病原菌发病过程中所发挥的作用。4、将野生型、AK突变体以及回补体孢子滴加到察比克培养基上,分析在不同逆境情况下菌株生理指标(菌落直径和产孢量)的差异。同时,将野生型、STT3突变体以及回补体孢子滴加到含有不同碳源的培养基上,分析菌株生理指标(菌落直径和产孢量)的差异,从而进一步探索STT3基因在碳源利用率方面所发挥的作用。5、构建含有靶标基因稳定遗传的Gateway干扰载体,转化本氏烟草。对获得的阳性植株接种病原菌,并对其进行抗病性分析以及分子水平检测。本实验利用突变体和回补体的构建以及稳定遗传阳性植株的获得,进一步探索AK和STT3基因在病原菌生长发育以及毒力方面发挥的作用,为农作物病虫害的防治提供了一定的实验数据和理论基础。