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目的:宫颈癌患者死亡的主要原因是肿瘤的复发、未控和转移,且约有35%的患者会发生复发/未控。复发/未控的治疗难点在于:受之前治疗手段的影响(手术、放疗或化疗),后续治疗方法常常受到限制,预后很差。血管新生是宫颈癌发生发展中的重要步骤,目前抗血管新生药物联合化疗已成为复发/未控性宫颈癌的首选治疗方案。但现有的抗血管新生药物仍存在很多局限,在降低副反应、降低费用、提高疗效等方面仍有很大的提升空间。临床上迫切需要寻找经济有效、低毒安全的新型抗血管新生药物,从植物提取物中研发抗血管新生药物是一个极富吸引力的方向。7-二氟亚甲基-5,4’-二甲烷氧基异黄酮(7-difluoromethoxy-5,4’-dimethoxygenistein,DFMG)是本课题组前期从植物中提取的新化学实体,已证实能通过调控Toll样受体4(Tolllike receptor 4,TLR4)抑制动脉粥样硬化过程中的血管新生。有研究表明宫颈癌细胞中TLR4呈高表达状态,且与VEGF-A之间存在明显正相关性,研究猜想DFMG是否可通过调控TLR4/VEGF-A路径抑制宫颈癌血管新生。本课题以宫颈癌Siha细胞和静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell-12,HUVE-12)为研究对象,探讨DFMG对宫颈癌血管新生的影响及其可能作用机制,为宫颈癌药物治疗的研发提供理论基础。方法:1.CCK-8试剂盒方法检测不同浓度(0,25,50,100μmol/L)DFMG分别孵育Siha细胞和HUVE-12细胞24 h后的细胞活性,选择合适浓度;2.基质胶小管形成、细胞划痕、CAM膜血管形成实验观察DFMG、金雀异黄素、贝伐单抗分别对Siha细胞和HUVE-12细胞血管新生的影响;3.ELISA检测DFMG、金雀异黄素、贝伐单抗分别孵育Siha细胞和HUVE-12细胞24 h后上清液中的VEGF-A蛋白浓度;Western Blot检测细胞中VEGF-A表达量;4.TLR4基因过表达慢病毒转染Siha细胞,并建立稳定过表达TLR4的Siha细胞系;TLR4基因小干扰RNA瞬时转染Siha细胞,倒置荧光显微镜下观察荧光效率,Western Blot和q RT-PCR检测转染是否成功;5.基质胶小管形成、细胞划痕、CAM膜血管形成实验观察Siha细胞培养上清中加入VEGF-A或VEGF-A抗体贝伐单抗后对血管新生的影响,同时观察TLR4过表达的Siha细胞培养上清中加入VEGFA抗体贝伐单抗及TLR4沉默表达的Siha细胞培养上清中加入VEGFA细胞因子后对血管新生的影响;6.基质胶小管形成、细胞划痕、CAM膜血管形成实验观察DFMG对过表达或沉默表达TLR4的Siha细胞血管新生的影响;7.ELISA检测DFMG孵育过表达或沉默表达TLR4的Siha细胞后上清液中的VEGF-A蛋白浓度;Western Blot和q RT-PCR检测细胞中VEGF-A、TLR4的表达量。结果:1.50μmol/L DFMG能抑制Siha细胞活性作用,而不影响HUVE-12细胞,故选择50μmol/L DFMG研究其对宫颈癌血管新生的影响;2.DFMG可抑制宫颈癌血管新生,且作用强于金雀异黄素,弱于贝伐单抗;同时贝伐单抗可抑制HUVE-12细胞血管新生,而DFMG、金雀异黄素对其无影响;3.DFMG抑制Siha细胞VEGF-A蛋白的表达和分泌,且作用强于金雀异黄素,弱于贝伐单抗;同时贝伐单抗抑制HUVE-12细胞VEGF-A蛋白的表达和分泌,而DFMG、金雀异黄素对其无影响;4.荧光显微镜下观察荧光效率已达到90%以上,Western Blot和q RT-PCR验证TLR4基因过表达慢病毒和小干扰RNA转染Siha细胞均成功;5.Siha细胞培养上清中加入VEGF-A可促进血管新生,加入贝伐单抗则抑制血管新生;而上清液中加入贝伐单抗可拮抗Siha细胞中TLR4过表达的促血管新生作用,上清液中加入VEGF-A可拮抗Siha细胞中TLR4沉默表达的抑制血管新生作用;6.Siha细胞过表达TLR4后,DFMG抑制血管新生的能力减弱;Siha细胞沉默表达TLR4后,DFMG抑制血管新生的能力增强;7.Siha细胞中TLR4的过表达可拮抗DFMG抑制TLR4的表达及VEGF-A的分泌与表达的作用,而Siha细胞中TLR4的沉默表达可协同DFMG抑制TLR4的表达及VEGF-A的分泌与表达。结论:1.DFMG可抑制宫颈癌血管新生。2.TLR4/VEGF-A路径可调控宫颈癌血管新生。3.DFMG抑制宫颈癌血管新生,其机制可能与调控TLR4/VEGFA路径相关。