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柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的柑桔衰退病,严重威胁着世界柑桔的发展。该病害主要通过蚜虫和嫁接传播,而我国CTV及其强力传媒褐色橘蚜(Toxoptera citricida Kirkaldy)广泛分布。目前我国柑桔的栽培面积和产量分别居世界第一位和第二位,随着柚类、甜橙类和杂柑类的种植比例日趋增大,茎陷点型衰退病在柚类、敏感的甜橙和杂柑类的危害日益严重,已经成为生产上突出问题。依据国外经验,在CTV强毒株和褐色桔蚜共存的地区,弱毒株交叉保护技术(MSCP)是防治柑桔茎陷点型衰退病最有效的措施。由于MSCP往往具有品种和地域专化性,了解不同品种对CTV分离株和不同来源的毒源株系的分布和互作规律,为弱毒株交叉保护的应用提供有力的参考依据。
本研究应用直接组织点免疫(DTBIA)对田间植株和原原种保存圃植株进行初筛,选用五大类13个阴性样品植株作为寄主,将不同来源的CTV强毒分离株CT14(1组群)、C13&(1+3+6组群)和CTl7(1+3组群)接种在上面。DTBIA检测后的阳性样品,应用反转录—多聚酶链式反应(RT—PCR)扩增CTV分离株的衣壳蛋白基因(CPG),结合限制性内切酶HinfⅠ对PCR产物进行限制性片段多态性(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP),同时对部分亚分离株进行p25基因序列测定。主要研究结论有:
1.RFLP分析:对DTBIA检测为阳性的亚分离株进行了RFLP分析,其中单一组群的毒源分离株(CT14,第1组群)嫁接到不同柑桔品种以后,RFLP组群未发生改变;混合组群CT36(1+3+6组群)嫁接到不同柑桔品种以后,RFLP组群发生了一定的改变,在柚类寄主上p25/HinfⅠ RFLP为第1组群、第6组群和3+6混组群三种形式,杂柑上p25/HinfⅠ RFLP为第6组群和3+6混组群两种组群形式,宽皮柑桔和甜橙是3+6混组群。混组群CT17(3+6组群)接种至不同寄主品种后,在柚类品种CTV亚分离株的p25/HinfⅠ RFLP为第3组群和1+3混组群,在杂柑上为第1组群和1+3混组群,甜橙上为第1组群、第3组群和1+3混组群三种形式,在宽皮柑桔上为第1组群、第3组群和1+3混组群三种形式。
2.SSCP分析:CT17、CT36混组群接种在不同寄主品种上SSCP图谱差异明显,分别出现2、4、6和8条谱带,表现多态性。
3.P25基因序列分析:对接种毒源CT17变异后的单组群亚分离株进行序列分析比对,不同CTV株系来源的相同变异组群亚分离株4-1、4-4、4-19、4-24、4-25和4-30在CPGs同源性为100%,4-12、4-34、4-38和4-42四个亚分离株的同源性为100%。第3组群的4-12与第1组群的3个亚分离株同为一簇,在进化树上有细微差异,再次验证隐藏的株系不一定消失;第1组群和第3组群的亚分离株同为一分枝上两簇,同源性较近。
4.生物学特性分析:不同品种接种CTV后的亚分离株表明,凤凰柚、沙田柚对茎陷点型衰退病敏感,一年生苗木上可表现症状;蜜奈夏橙、琯溪蜜柚、强德勒红心柚、岩溪晚芦、红桔、天草和不知火等品种症状不明显。田间脱毒苗木不同砧穗组合检测结果说明脱毒苗木不能阻止CTV的发生,且能在很短的时间内感染。