第一部分脓毒症小鼠PD-L1+中性粒细胞的比例变化目的:制作脓毒症小鼠模型,了解脓毒症发病过程中PD-L1+中性粒细胞比例的变化趋势。方法:⒈C57BL/6小鼠（雄性,8-10周龄,重20-25g）以0.3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后,使用盲肠结扎穿孔法制作脓毒症小鼠模型（CLP组）。假手术组（Sham组）为对照组,即开腹后直接关闭腹腔而不行盲肠结扎穿孔。⒉按造模后时间点24小时、48小时、72小时和96小时分别在麻醉状态下心脏采血,白细胞以Anti-Mouse Ly-6G、Anti-Mouse CD274染色,然后用流式细胞仪检测中性粒细胞中PD-L1+细胞的比例,Ly-6G+和CD274+的双阳性细胞定义为PD-L1+中性粒细胞。⒊骨髓取自股骨,骨髓中性粒细胞中PD-L1+细胞比例的检测方法同血液的流式细胞术。结果:⒈制作CLP组小鼠25只,其中2只手术后未成功苏醒,其余23只术后顺利苏醒并有脓毒症的表现。制作15只Sham组小鼠,术后均顺利苏醒。⒉在血液中,CLP组小鼠PD-L1+中性粒细胞的比例在24小时、48小时、72小时和96小时分别为4.433±0.77%、9.583±2.222%、16.3±3.716%和12.933±1.877%;而Sham组小鼠PD-L1+中性粒细胞的比例在24小时、48小时、72小时和96小时分别为2.647±1.117%、3.867±1.22%、7.003±0.512%和4.387±2.531%。通过统计学分析发现,CLP组小鼠血液PD-L1+中性粒细胞的比例在48小时、72小时和96小时显著高于Sham组小鼠（P<0.05）。⒊在骨髓中,CLP组小鼠PD-L1+中性粒细胞的比例在24小时、48小时、72小时和96小时分别为10.867±0.493%、14.7±1.353%、25.367±6.037%和17.433±2.616%;而Sham组小鼠PD-L1+中性粒细胞的比例在24小时、48小时、72小时和96小时分别为6.197±1.127%、5.2±2.05%、9.8±1.928%和9.417±2.029%。通过统计学分析发现,CLP组小鼠骨髓PD-L1+中性粒细胞的比例在24h、48h、72h和96h均显著高于假手术组小鼠（P<0.05）。结论:⒈盲肠结扎穿孔法是制作脓毒症小鼠模型的理想方法。⒉脓毒症发病过程中小鼠血液及骨髓PD-L1+中性粒细胞的比例逐渐升高,约在72小时达到峰值。第二部分阿特珠单抗应用于脓毒症小鼠免疫治疗的疗效分析目的:通过内毒素水平、肠通透性、回肠病理组织学评分、回肠紧密连接蛋白表达及生存分析来评估阿特珠单抗对脓毒症小鼠的治疗效果。方法:⒈实验分组为Sham组、CLP组及Atezolizumab组三个组,Atezolizumab组为使用阿特珠单抗治疗的脓毒症小鼠。Sham组15只,CLP组27只,Atezolizumab组27只,其中三个组各15只用于检测内毒素水平、肠通透性、回肠病理组织学评分、回肠紧密连接蛋白表达,另外12只CLP组小鼠及12只Atezolizumab组小鼠用于生存分析。⒉造模后24小时、48小时及72小时时间点分别在麻醉下心脏采血,以鲎试剂法检测内毒素水平;⒊采血前5小时小鼠给予荧光标记右旋糖酐（Fluorescently labeled dextran 40S,FD40S）灌胃给药,按造模后24小时、48小时及72小时时间点分别在麻醉状态下心脏采血,用荧光分光光度计检测各样本荧光值并根据标准曲线换算成浓度值,以FD40S的浓度来反映肠通透性。⒋在造模后72小时时间点分别在麻醉状态下切取一段回肠,行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色,根据Chiu评分法行回肠病理组织学评分。⒌在造模后72小时时间点分别在麻醉状态下切取一段回肠,行免疫组织化学法检测紧密连接蛋白的表达,比较各组小鼠回肠claudin-1蛋白、occludin蛋白和zonula occludens-1（ZO-1）蛋白的表达差异。⒍记录CLP组小鼠和Atezolizumab组小鼠的死亡时间,绘制生存曲线,log-rank统计学检验对比两组小鼠生存时间的差异。结果:⒈Sham组小鼠在术后24小时、48小时和72小时测得的血液内毒素水平分别为0.224±0.008 EU/ml、0.241±0.128 EU/ml和0.23±0.064EU/ml;CLP组小鼠内毒素水平分别为0.496±0.102 EU/ml、0.742+0.153 EU/ml和0.956±0.162EU/ml;而Atezolizumab组小鼠内毒素水平分别为0.477±0.069EU/ml、0.488±0.145 EU/ml和0.564±0.128EU/ml。通过统计学分析发现,CLP组小鼠在24小时、48小时和72小时的内毒素水平比Sham组显著升高（P<0.05）。而与CLP组的小鼠相比,Atezolizumab组小鼠在24小时、48h和72h内毒素水平显著降低（P<0.05）。⒉Sham组小鼠在手术后24小时、48小时和72小时的FD40S浓度分别为1.754±0.575 ug/ml、2.758±0.636 ug/ml和3.473±1.434 ug/ml,CLP组小鼠在手术后24小时、48小时和72小时的FD40S浓度为8.919±2.681 ug/ml、25.024±3.68 ug/ml和32.283±3.456 ug/ml,而Atezolizumab组小鼠在手术后24小时、48小时和72小时的FD40S浓度分别为8.519±2.335 ug/ml、13.1±4.098 ug/ml和17.981±3.211 ug/ml。通过统计学分析发现,CLP组小鼠在24小时、48小时和72小时的FD40S浓度比Sham组小鼠显著升高（P<0.05）。而与CLP组小鼠相比,Atezolizumab组小鼠在48小时和72小时的FD40S浓度显著降低（P<0.05）。⒊Sham组小鼠的回肠组织病理学评分为0.875±0.835,CLP组小鼠回肠组织病理学评分为3.5±1.069,Atezolizumab组小鼠的回肠组织病理学评分为2.25±1.035。统计学分析发现,CLP组小鼠的回肠组织病理学评分显著高于Sham组小鼠（P<0.05）,而Atezolizumab组小鼠的回肠组织病理学评分显著低于CLP组小鼠（P<0.05）。⒋在回肠claudin-1蛋白表达方面,Sham组小鼠为1.03±0.061,CLP组小鼠为0.652±0.17,Atezolizumab组小鼠为0.846±0.127。CLP组小鼠的claudin-1蛋白表达显著低于Sham组小鼠的claudin-1蛋白表达（P<0.05）,而Atezolizumab组小鼠的claudin-1蛋白表达高于CLP组小鼠的claudin-1蛋白表达（P<0.05）。在回肠occludin蛋白表达方面,Sham组小鼠为1.02±0.125,CLP组小鼠为0.68±0.194,Atezolizumab组小鼠为0.888±0.122。CLP组小鼠的occludin蛋白表达显著低于Sham组小鼠的occludin蛋白表达（P<0.05）,而Atezolizumab组小鼠的occludin蛋白表达明显高于CLP组小鼠的occludin蛋白表达（P<0.05）。在回肠ZO-1蛋白表达方面,Sham组小鼠为1.01±0.137,CLP组小鼠为0.794±0.124,Atezolizumab组小鼠为0.896±0.092。CLP组小鼠的ZO-1蛋白表达显著低于Sham组小鼠的ZO-1蛋白表达（P0.05）。⒌经阿特珠单抗治疗的脓毒症小鼠具有更长的生存时间（P<0.05）。在90小时内,CLP组小鼠约有50%的小鼠死亡,而Atezolizumab组小鼠中只有约25%的小鼠死亡。结论:⒈脓毒症时小鼠血中内毒素水平升高、肠上皮细胞受损、紧密连接蛋白表达下降,导致肠粘膜屏障受到损害、肠通透性增加,肠粘膜屏障的损害反过来加重脓毒症病情,形成恶性循环。⒉应用阿特珠单抗治疗可减少脓毒症小鼠血中的内毒素水平,减轻肠上皮细胞的损伤,增加肠道紧密连接蛋白的表达,保护肠粘膜屏障,延长脓毒症小鼠的生存时间。第三部分从生物信息学角度探索阿特珠单抗的作用机制目的:了解脓毒症应用阿特珠单抗治疗前后的基因表达变化,探索阿特珠单抗治疗脓毒症的分子生物学机制。方法:实验分组同上一部分。Sham组小鼠、CLP组小鼠及Atezolizumab组小鼠造模后72小时时间点在麻醉状态下心脏采血,每组各采血5只小鼠,分离中性粒细胞,提取RNA后进行表达谱测序。应用DESeq软件进行测序数据分析、筛查差异表达的基因,将筛查得到的差异表达基因进行PPI（Protein-protein interaction）网络构建、GO（Gene ontology）注释分析、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路分析。结果:CLP组小鼠的基因表达较Sham组小鼠上调的基因有375个,而下调的基因有275个;Atezolizumab组小鼠的基因表达较CLP组小鼠上调的基因有94个,而下调的基因有27个。CLP组小鼠对比Sham组小鼠最显著上调的信号通路是TNF signaling pathway。Atezolizumab组小鼠对比CLP组小鼠最显著上调的信号通路是Leukocyte transendothelial migration。结论:⒈基因表达处于动态变化中,基因表达的差异往往决定了表型的差异。⒉脓毒症上调的最显著信号通路是TNF信号通路,提示脓毒症发病过程中出现明显的炎症反应。⒊阿特珠单抗治疗的脓毒症小鼠上调的最显著信号通路主要是白细胞跨内皮迁移,提示阿特珠单抗提高了机体的免疫防御能力。第四部分体外细胞实验探索阿特珠单抗治疗脓毒症的作用机制目的:体外实验证明阿特珠单抗对抗脓毒症中性粒细胞引起的T淋巴细胞凋亡并初步探索其作用机制。方法:⒈从小鼠提取的中性粒细胞,和培养的T淋巴细胞系按1:1比例共培养24小时。分为三组,每组8只小鼠,Sham组为假手术小鼠的中性粒细胞+T淋巴细胞系+同型抗体Ig G2a（10ug/ml）,CLP组为脓毒症小鼠的中性粒细胞+T淋巴细胞系+同型抗体Ig G2a（10ug/ml）,Atezolizumab组为脓毒症小鼠的中性粒细胞+T淋巴细胞系+阿特珠单抗（10ug/ml）。经过Annexin V-FITC、PI、Anti-CD3-APC染色后上流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡细胞。⒉取5只脓毒症小鼠的血液样本,分别提取中性粒细胞,和T淋巴细胞系按1:1比例共培养24小时。经过Anti-PD-1染色,检测表达PD-1的T淋巴细胞的比例。结果:⒈Sham组、CLP组和Atezolizumab组的T淋巴细胞凋亡率分别为8±1.638%、27±2.855%和12.93±2.15%。经过统计分析,CLP组的T淋巴细胞凋亡率比Sham组明显增加（P<0.05）,而Atezolizumab组的T淋巴细胞凋亡率比CLP组明显降低（P<0.05）。⒉5份共培养的T淋巴细胞均可以表达PD-1,表达PD-1的T淋巴细胞比例中位数为21.9%。结论:⒈脓毒症发病后中性粒细胞诱导T淋巴细胞的凋亡增加。⒉PD-L1抗体阿特珠单抗可降低脓毒症中性粒细胞诱导的T淋巴细胞凋亡率,其可能通过阻断PD-1/PD-L1信号通路起作用。