喉返神经损伤导致的声带麻痹的治疗一直是喉科领域的难点和热点问题，尽管神经修复可使失神经喉肌获得再生，但喉肌功能仍难以恢复正常。其重要原因之一是喉肌肌卫星细胞（成肌细胞）功能受损。肌卫星细胞是骨骼肌成肌细胞，其向受损部位迁移是骨骼肌再生过程的关键环节。受损肌纤维释放的信号分子诱导成肌细胞迁移至受损部位，其通过直接融合生成新生肌纤维或与受损肌纤维融合而完成修复，此过程涉及复杂的化学趋向诱导、细胞骨架重组等程序化的分子细胞事件。研究表明嘌呤能受体P2家族不同成员的时空差异性表达与成肌细胞的功能调控密切相关，我们课题组已研究表明在骨骼肌损伤后成肌细胞P2Y6表达上调并呈特异性的极性分布，提示P2Y6受体可能参与前体细胞和肌管的迁移，但确切机制尚不清楚。本课题拟通过基因修饰、特异性药物干预等技术，阐明P2Y6受体信号通路调控成肌细胞迁移的作用及信号转导机制。本研究旨在揭示P2Y6受体调控成肌细胞对失神经喉肌再生的作用和确切机制，为促进失神经喉肌等骨骼肌的再生和功能恢复，提供新的治疗思路及理论依据。本研究共分为三个部分。第一部分P2Y6RNAi慢病毒成肌细胞稳定株的构建目的：采用shRNA干扰技术沉默P2Y6受体表达并构建shP2Y6成肌细胞。方法：利用shRNA干扰技术针对不同的基因位点构建一系列的shP2Y6C2C12细胞及空白病毒shCtrl C2C12细胞，并通过qPCR和WB验证转染效率，并挑选出干扰效率最好的两株细胞。结果：共构建空白病毒对照株C2C12UETP和8个慢病毒稳定株C2C12shB202-C2C12shB209，其中C2C12shB203和C2C12shB206干扰效率最好，分别为（78.1%±6.4%）和（71.8%±2.9%）。结论：成功构建P2Y6RNAi慢病毒成肌细胞稳定株，且shB203的干扰效率最好。第二部分P2Y6受体调控成肌细胞增殖、分化、迁移的作用目的：探讨P2Y6受体调控骨骼肌成肌细胞增殖、分化和迁移的确切作用。方法：基因干预组分为空质粒C2C12shCtrl组和慢病毒C2C12shP2Y6-1、shP2Y6-2组。药物刺激组分为：10μM、50μM、100μMUDP处理组、1μM、5μM、10μMMRS2578处理组和空白对照组。MTS和CCK-8法检测不同处理组细胞增殖能力的差异；qPCR方法检测基因干扰组成肌细胞分化指标Myogenin、MyoD的mRNA水平的差异；细胞划痕和Transwell迁移方法检测不同处理组成肌细胞迁移能力的差异，结果：与对照组相比，不同处理组间成肌细胞的增殖活性降低无统计学意义（p>0.05）；与对照组相比，基因干扰组成肌细胞在分化不同时间点（0d、1d、2d、3d、5d、6d）的MyoD、Myogenin转录水平的变化差异无统计学意义（p>0.05）。而基因干扰组和10μMMRS2578处理组的成肌细胞的迁移能力显著增加，与对照组比较，差异有统计学意义（p<0.05）。结论：P2Y6受体参与调控成肌细胞的增殖和分化环节中细胞迁移运动。第三部分P2Y6受体调控成肌细胞迁移作用的机制研究目的：用WB检测基因干扰组β-catenin、N-cadherin、MMP2的蛋白表达；利用基因芯片分析P2Y6受体调控成肌细胞迁移相关的信号通路。方法：利用慢病毒C2C12shP2Y6干扰组和空质粒C2C12shCtrl组，通过基因芯片分析比较并找出两组间的基因表达水平差异超过2倍（p<0.05）的基因，将这些基因提交IPA分析，预测出迁移相关信号通路。结果：与对照组相比，基因干预组β-catenin的蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（p<0.01）。基因芯片分析得出124个表达升高和21个表达降低的基因，其中42个差异表达最显著，30个迁移相关分子中有21个的表达变化预示迁移能力的增加，分析得出28种相关信号通路，并预测P2Y6受体调控成肌细胞迁移相关的经典HGF和NF-κB信号通路网络。结论：基因芯片分析显示P2Y6沉默后大量迁移分子的激活预示着细胞迁移的功能被激活，迁移运动与细胞骨架运动蛋白β-catenin的调控相关，IPA分析预测其调控成肌细胞迁移的信号通路可能是经典HGF和NF-κB通路，确切作用途径有待进一步证实。全文结论：小鼠骨骼肌发育和损伤再生过程中，P2Y6受体的特异性时空表达模式提示其可能通过调控成肌细胞功能参与骨骼肌发育和再生。功能学实验证实了P2Y6受体为参与调控成肌细胞的增殖和分化环节中成肌细胞的迁移能力及细胞骨架调控直接相关。基因芯片证实了P2Y6受体调控的下游靶基因主要是与细胞运动及骨架调控相关的基因，而经典HGF和NF-κB通路网络可能是P2Y6受体调控成肌细胞迁移的主要信号转导途径。