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目的:研究piRNA调控人的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells of human,HA-VSMC)增殖迁移的作用和机制,可能为动脉粥样硬化临床靶向治疗提供新的潜在靶点。方法:(1)APOE-/-小鼠高脂喂养12周构建动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)小鼠模型;高通量测序、实时荧光定量聚合链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和低脱氧核糖核苷三磷酸反转录法(RTLP)筛选和鉴定发挥潜在作用的候选基因小分子非编码piRNA(PIWI-interacting RNA,piRNA);检测目的piRNA在各组织和细胞系中表达,选定合适细胞系。(2)piRNA敲低和过表达验证其是否调控HA-VSMC功能;CCK8、Ed U、transwell和细胞划痕实验检测piRNA对HA-VSMC增殖和迁移的影响。(3)生物信息学方法预测目的piRNA下游靶标蛋白,RT-qPCR和蛋白免疫印迹验证其表达变化。(4)合成沉默靶蛋白表达基因,验证是否在细胞中成功表达;CCK8、Ed U、transwell和细胞划痕实验检测靶标蛋白对HA-VSMC生物学功能的影响。(5)共转染piRNA和靶蛋白,CCK8、Ed U、transwell和细胞划痕实验等检测piRNA是否通过调控靶蛋白对HA-VSMC生物学功能产生影响。(6)生物信息学分析和亚硫酸盐法验证piRNA是否通过甲基化调控靶标蛋白表达。(7)将小鼠分为NC组,AS组和piR-16组,取主动脉,油红染色观察斑块大小,荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验观察和对比分析piR-16在各组表达情况。(8)AS病人血清样本中提取RNA,RT-qPCR检测目的piRNA表达量。结果:(1)高通量测序、RT-qPCR和RTLP确定piR-16为目的基因。选择HA-VSMC进行下一步实验。(2)转染合成的piR-16 mimic和piR-16 inhibitor,RT-qPCR验证转染效果良好(P<0.05);CCK8、Ed U、transwell和划痕结果显示piR-16 mimic组与NC组相比细胞增殖和迁移速率明显降低(P<0.05)。(3)蛋白免疫印迹和RTqPCR实验表明,与NC组相比piR-16 mimic组核内不均一性核糖核蛋白K(heterogeneous ribonucleoprotein K,hn RNPK)m RNA及蛋白表达水平均下调(P<0.05)(4)与NC组相比,si-hn RNPK组hn RNPK的m RNA及蛋白的表达均下调(P<0.05)。(5)CCK8、Ed U、transwell和划痕检测结果均显示与si-hn RNPK组相比piR-16-inhibitor+si-hn RNPK组细胞增殖迁移速率明显增加(P<0.05)。(6)亚硫酸盐实验表明,piR-16可能通过促进hnRNPK启动子区CpG岛发生甲基化沉默hn RNPK表达。(7)与NC组相比AS组小鼠主动脉弓出现明显斑块且面积较大,piR-16组小鼠主动脉弓斑块减少且面积明显小于AS组。(8)在临床病人血液样本中,AS病人血清中piR-16表达量明显低于健康人。结论:piR-16在AS小鼠主动脉和病人血液样本中表达下调;在HA-VSMC中,piR-16可通过靶向调控hn RNPK甲基化抑制细胞增殖和迁移。因此,piR-16在动脉粥样硬化中发挥重要作用,可能为临床上治疗动脉粥样硬化提供新的靶标。