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1冷冻保护剂调节卵母细胞中AQP7表达而促进冷冻过程中水转运的研究目的：检测卵母细胞中AQP7在卵母细胞冷冻保存中的作用材料与方法：1.收集行人MⅡ期卵母细胞和C57BL/6J小鼠MⅡ期卵母细胞,检测水通道蛋白AQP3,7,9的mRNA和蛋白水平的表达。2.比较卵母细胞在汞离子处理和不处理两种情况下,卵母细胞的对低渗溶液膨胀能力和对水的转运速率。3.分别用8%乙二醇(EG),9.5%DMSO和0.5M蔗糖的HTF溶液处理卵母细胞,检测AQP3,7,9蛋白的表达。4.转染表达GFP-hAQP7融合蛋白载体到293T细胞中,分别用EG, DMSO和蔗糖的DMEM溶液处理,实时监测细胞中GFP-hAQP7蛋白表达变化。5.使用显微操作仪固定卵母细胞,实时监测卵母细胞在EG, DMSO溶液中体积的变化。6.比较使用EG和DMSO作为冷冻保护剂,卵母细胞的存活率。结果：1.在人和小鼠的MⅡ期的卵母细胞中,都能检测到AQP3,7,9的mRNA和蛋白水平的表达。2.卵母细胞在汞离子处理后,对低渗溶液膨胀能力减弱,对水的转运速率降低。3.乙二醇(EG), DMSO和蔗糖可使卵母细胞AQP7蛋白表达水平上调,并且DMSO处理后上调效应最强烈。而AQP3和9表达水平并没有改变。4. EG, DMSO和蔗糖可以上调293T细胞中GFP-hAQP7蛋白表达。并且同样是DMSO处理组GFP-hAQP7蛋白表达上调效应最明显。5.相比较EG,卵母细胞在DMSO溶液中体积的变化更快。6.相比较EG,用DMSO做冷冻保护剂,卵母细胞冷冻保存后的存活率低。结论：DMSO比EG更能刺激卵母细胞中AQP7表达上调。这个上调作用可以促进卵母细胞在冷冻保存过程中对水的渗透,减少卵母细胞达到渗透压平衡时间。2AQP7在卵母细胞成熟和冷冻中的功能的研究目的：阐明AQP7在卵母细胞成熟和冷冻保存中的功能材料与方法：1.收集自然周期和控制超促排卵(COH)的小鼠MⅡ期卵母细胞,分别进行体外受精实验。比较两组细胞受精率。用Real-time PCR检测两组细胞AQP7mRNA表达差异。2.收集GV期和MⅡ期卵母细胞,运用Real-time PCR比较这两种时期卵母细胞中AQP7的mRNA表达差异。运用细胞免疫荧光方法检测AQP7蛋白在这两种细胞中分布差异。3.采用显微注射技术将AQP7siRNA注射到GV期卵母细胞中,敲减AQP7的表达。与注射Sramble siRNA比较,计算卵细胞体外的成熟率。4.收集自然周期的MⅡ期卵母细胞,分别用含有insulin, LH和FSH这三种激素的HTF培养细胞1h,采用免疫荧光方法检测AQP7的在细胞内的分布的改变。5.收集GV,M Ⅰ和MⅡ期卵母细胞,采用免疫荧光方法检测这三种时期的卵母细胞中AQP7与F-actin的共定位情况。6.分别使用EG和DMSO对卵母细胞玻璃化冷冻,解冻后和新鲜卵母细胞同时进行体外受精,计算受精率。7.新鲜未冷冻的卵母细胞作为对照组,采用免疫荧光法检测卵母细胞玻璃化冷冻解冻后2h后,AQP7的表达情况。8.分别注射Sramble RNA和AQP7siRNA到GV卵母细胞,体外培养16-18h后,使用EG进行玻璃化冷冻,解冻统计存活率。结果：1.COH组组卵母细胞体外受精率明显低于自然周期组,并且COH组MⅡ期卵母细胞AQP7mRNA表达水平显著低于自然周期组。2.MⅡ期卵母细胞AQP7mRNA表达水平显著低于GV期。在MⅡ期卵母细胞中,相比较GV期而言,AQP7更多分布在细胞膜上,细胞质重分布明显减少。3.注射靶向AQP7的siRNA到GV期卵母细胞中敲减AQP7表达后,卵母细胞成熟率显著降低。4. Insulin和LH处理后,AQP7在卵母细胞膜上分布增多,细胞质中分布减少。而使用FSH处理,AQP7分布并没有改变。5. GV, M I和MⅡ期卵母细胞中都能检测到AQP7与F-actin共定位。随着卵母细胞的发育,AQP7在这三种时期细胞内细胞质中的分布减少,细胞膜上分布增多。而F-actin正好相反,在胞质中的分布增多,细胞膜上分布减少。6.使用DMSO或者EG作为冷冻保护剂冻存的卵母细胞解冻后体外受精能力没有差异,均低于新鲜对照组。AQP7表达量在DMSO和EG组之间并没有显著差异,但均高于未冷冻的对照组。7.AQP7表达敲减后,卵母细胞冷冻保存后存活率是显著降低。结论：AQP7通过与F-actin共定位在一起,通过F-actin运输作用,在卵母细胞从GV期发育到MⅡ期过程中从胞质向胞膜上转运,参与卵母细胞的成熟。敲减AQP7表达后,卵母细胞冷冻保存后的存活率显著降低。3冷冻保护剂和高渗透压刺激卵母细胞中AQP7表达和定位的改变是通过PI3K/PKC通路调节的机制研究目的：明确冷冻保护剂和高渗透压刺激卵母细胞中AQP7表达和定位改变的分子机制。材料与方法：1.采用细胞免疫荧光和蛋白免疫印(Western blotting)检测卵母细胞上蛋白CPEB和Aurora A磷酸化和总蛋白在冷冻保护剂EQDMSO和蔗糖溶液处理后的表达水平。2.分别Staurosporine/HTF, LY294002/HTF, U0126/HTF, SP600125/HTF预处理MⅡ期的卵母细胞,第五组为对照。再用8%EG/HTF溶液处理20min后采用免疫荧光方法检测AQP7, CPEB,磷酸化CPEB, Aurora A和磷酸化Aurora A蛋白表达水平。3.293FT细胞中表达GFP-hAQP7,同2使用方法处理,激光共聚焦显微镜下检测GFP-hAQP7的表达量。用Western blotting检测GFP-hAQP7蛋白水平。4.用浓度分别为0.25M,0.5M,0.7M,1M蔗糖的高渗透压溶液分别处理卵母细胞20min, HTF为对照组,使用免疫荧光方法检测各组AQP7的表达。5.293FT细胞转染GFP-hAQP7载体,48h后分别用DMSO,EG和蔗糖溶液处理20min, HTF组为对照。使用激光共聚焦显微镜下检测各组GFP-hAQP7的表达。转入pEGFP-Cl载体作为对照。6.对表达GFP-hAQP7的293FT细胞,裂解细胞,使用免疫共沉淀的方法检测AQP7和F-ACTIN在细胞中绑定情况。结果：1. EG, DMSO和蔗糖均可以上调卵母细胞中磷酸化的CPEB蛋白表达水平。DMSO组与EG组比较起来,DMSO上调磷酸化的CPEB蛋白表达更多。CPEB磷酸化的上游激酶Aurora A的磷酸化蛋白水平也被上调,DMSO上调效应最明显。总蛋白表达水平不变。2.PKC通路抑制剂Staurosporine和PI3K通路抑制剂LY294002可以显著抑制冷冻保护剂EG对AQP7表达上调的效应,而Erkl/2通路和JNK通路抑制剂对上调效应并没抑制作用。在表达GFP-hAQP7的293FT细胞上发现同样的结果。3.在卵母细胞水平上,PKC和P13K通路抑制剂可以抑制CPEB和Aurora A磷酸化水平表达增高的效应。4.AQP7表达水平随着渗透压增大而上升。并且随着渗透压增大,AQP7在细胞膜上分布增多。在表达GFP-hAQP7的293FT细胞上,冷冻保护剂所形成的高渗透压溶液同样也能刺激GFP-hAQP7在细胞膜上表达增多。5.免疫共沉淀实验结果显示细胞内AQP7和F-ACTIN绑定在一起。结论：冷冻保护剂通过PI3K/PKC通路激活卵母细胞内调控mRNA翻译的蛋白CPEB和Aurora磷酸化活性来上调AQP7表达。高渗透压刺激卵母细胞中AQP7在细胞膜上分布增加。在细胞内,AQP7和F-ACTIN绑定在一起。很可能通过F-ACTIN运动作用将AQP7由胞质中运输到胞膜上。