天人相应学说是中医理论体系的核心思想,它对中医理论的阴阳、五行、藏象、气血津液等有着重要的影响,尤其在藏象理论中,天人相应学说更是通过季节气候将五脏、六腑等与自然融为一体,形成了具有中医特色的“五脏应时”理论。然而目前对季节气候如何通过人体对五脏发挥作用的机制研究还处在初始阶段,所以如何运用现代科学技术,以中医天人相应的整体思维模式为基础,建立“五脏应时”的实验研究是亟待解决的问题。1.目的:以中医“肾应冬”为“五脏应时”研究的突破口,以下丘脑-垂体-甲状腺轴为主线,通过对其理论内涵的剖析,提出与肾实质密切相关的甲状腺轴研究的可行性思路,并通过内分泌激素水平、细胞信号转导水平的相关性实验研究,进一步证实该思路的可行性与科学性,从而为中医五脏的实质研究开辟新的方向和领域。2.方法:2.1理论研究:本文采用文献资料法和逻辑分析法,对中医“五脏应时”学说的中医理论内涵和神经内分泌免疫网络整体调节理论基础进行阐释和分析,提出中医“五脏应时”学说现代研究的可行性思路和途径,并对其实验研究的切入点进行探讨。2.2实验研究:(1)总体设计:本实验研究主要以“下丘脑-垂体-甲状腺轴”为主线,以对光强度极为敏感的松果腺为切入点,选择了在细胞信号转导途径中起重要作用的G蛋白和受体,以及内分泌系统分泌并释放的激素作为研究的对象,观察在生理状态下,大鼠冬夏季节下丘脑-垂体-甲状腺轴相应水平的G蛋白、TSH受体(MR)、TRH受体mRNA及促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素刺激激素(TSH)、三碘甲状腺氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)的变化。同时观察松果腺在此过程中的高位调节作用。(2)实验动物:SD大鼠,雄性,180-200 g/只。随机分成生理组、手术组、伪手术组,每组8只。实验大鼠接受自然光照,自由摄取食水,室温饲养(冬季室温为17℃±2℃,夏季室温为25℃±2℃)。在每年冬至、夏至日前一个月,手术组大鼠结扎矢状窦并摘除松果腺,伪手术组大鼠结扎矢状窦但不摘除松果腺,生理组大鼠不做任何手术。所有实验大鼠将被饲养至冬至、夏至当日晚九点,断头处死。(3)检测方法:G蛋白及TSH受体含量测定,运用Western Blot;TRH、TSH、T3、T4测定,运用放射免疫法;TRH受体mRNA,运用RT-PCR法。(4)分析方法:受体、G蛋白和TRH受体mRNA含量分析运用AlphaImager TM图像分析系统,所有数据将接受裂区设计的实验分析,该分析将运用SAS 8.02软件进行统计,并进行q检验。3.结果3.1理论研究结果(1)褪黑素在中医基础理论中发挥的作用非常关键,它是阐明中医基础理论中天人相应的整体思想的关键所在,也是研究“时脏相应”揭示五脏实质的关键所在,更是研究节律提倡因时制宜的关键所在,具有不可替代的重要地位。(2)西医的神经-内分泌-免疫网络注重机体的整体功能调节,符合中医“天人相应”的整体思想,体现了中医五脏的相生相克,制化平衡的机制。它是阐明五脏之间相互关系的物质基础,也是阐明五脏本身的物质基础。(3)以“五脏应时”为理论依据,通过“时”这个节律性变化因素研究神经-内分泌-免疫网络,既可以保证该网络体系研究的生理特性,又体现了其网络体系的整体性和特殊性,其研究方法符合中医的整体思想和以生理推断五脏实质的研究思路。3.2实验研究结果3.2.1季节因素对下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响(1)血清内分泌激素:T3(P<0.01)、T4(P<0.05)、TRH(P<0.05)三项指标冬夏比较:冬高夏低,差异显著;TSH含量冬夏比较没有显著性差异。(2)受体水平:甲状腺TSH受体含量冬夏比较:冬高夏低,差异显著,P<0.05。(3)基因水平:垂体TRH受体mRNA含量冬夏比较:冬高夏低,差异显著,P<0.05。(4)甲状腺轴G蛋白:下丘脑Gi、垂体Gq两项指标冬夏比较:冬高夏低(P<0.05),差异显著;而甲状腺Gi和甲状腺Gs冬夏比较没有显著差异。3.2.2手术因素对下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响(1)血清内分泌激素:SD大鼠血清T4在冬至生理组和冬至手术组之间比较有显著性差异,P<0.05;T3、TSH、TRH在生理组、手术组及伪手术组间比较没有显著性差异。(2)受体水平:TSH受体含量在在生理组、手术组及伪手术组间比较没有显著性差异。(3)基因水平:TRH受体mRNA含量在生理组和手术组之间比较有显著性差异,P<0.05。(4)甲状腺轴G蛋白:下丘脑的Gi、甲状腺的Gs蛋白在生理组和手术组之间比较都有显著性差异,P<0.05;垂体的Gq蛋白在冬至生理组和冬至手术组之间比较有显著性差异,P<0.05;甲状腺的Gi蛋白在在生理组、手术组及伪手术组间比较没有显著性差异。3.2.3手术与季节的交互作用。(1)血清内分泌激素:SD大鼠血清T3(P<0.05)、T4(P<0.05)、TSH(P<0.01)三项指标各自存在手术与季节的交互效应,也就是说季节因素产生的差别,可因手术施加的程度而异。而血清TRH没有手术与季节的交互效应。(2)受体水平:SD大鼠甲状腺TSH受体含量没有手术与季节的交互效应。(3)基因水平:SD大鼠垂体TRH受体mRNA含量没有手术与季节的交互效应。(4)甲状腺轴G蛋白:SD大鼠垂体Gq蛋白的含量存在手术与季节交互效应(P<0.05)。而下丘脑Gi、甲状腺Gs和Gi三项指标各自没有手术与季节的交互效应。4.结论(1)中医“肾应冬”调控机制与季节因素密切相关。(2)中医“肾应冬”调控机制与松果体密切相关。(3)从“五脏应时”角度研究中医脏象实质的思路是可行的。(4)本研究首次以季节变化为因素,以下丘脑-垂体-甲状腺轴为主线,从整体角度深入研究细胞信号转导机制,并通过实验证实中医“肾应冬”的规律与下丘脑-垂体-甲状腺轴整体调节机制下的细胞信号转导网络被激活密切相关。(5)本研究首次发现,手术摘除松果体对下丘脑-垂体-甲状腺轴的季节性变化规律有拮抗作用,也就是说褪黑素对甲状腺轴的影响在季节方面具有双重性。进而本文从细胞信号转导水平对该双重性进行了分析和论证。其实验意义是具有开创性的。