【摘 要】
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目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是常见的神经退行性疾病,研究发现PD疾病进展与小胶质细胞过度激活引起的神经炎症有关,但具体机制尚不明确。本研究旨在探讨在MPP+/MPTP模型中MIF通过NF-κB信号通路调节小胶质细胞NLRP3炎症小体的形成对PD模型的影响,阐述MIF介导的神经炎症在PD发挥的作用和机制。方法:本实验采用MPP+处理的小胶质细胞Bv-2细胞构建PD体
【基金项目】
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国家自然科学基金（81671275、81974195）; 广东省重点领域研发计划“脑科学与类脑研究”重大科技专项（2018B030337001）; 广东省科技计划项目“粤港澳联合创新领域”（2020A0505140006）; 国家重点研发计划项目（2017YFC1310200）; 广东省基础与应用基础研究基金项目（2019A1515110061）
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目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是常见的神经退行性疾病,研究发现PD疾病进展与小胶质细胞过度激活引起的神经炎症有关,但具体机制尚不明确。本研究旨在探讨在MPP+/MPTP模型中MIF通过NF-κB信号通路调节小胶质细胞NLRP3炎症小体的形成对PD模型的影响,阐述MIF介导的神经炎症在PD发挥的作用和机制。方法:本实验采用MPP+处理的小胶质细胞Bv-2细胞构建PD体外模型,应用蛋白免疫印迹法检测观察不同浓度MPP+诱导NLRP3和MIF的表达;利用慢病毒转染技术构建并筛选MIF敲低的Bv-2细胞稳定转染细胞（Bv2 LV-sh RNA）和阴性对照病毒的稳定转染细胞（Bv2 LV-con）,采用实时荧光定量PCR检测各组细胞目的基因MIF m RNA的转录水平和蛋白免疫印迹法检测目的蛋白MIF表达水平。设置分组为空白对照组（Bv-2细胞）、MPP组（Bv-2细胞予MPP+）、LV-con组（Bv-2 LV-con细胞予MPP+）、LV-sh RNA组（Bv-2 LV-sh RNA细胞予MPP+）进行实验,应用蛋白免疫印迹法检测各组细胞NLRP3、cleaved caspase-1、p65蛋白表达情况,应用酶联免疫吸附检测各组经过处理过的细胞上清液中IL-1β和IL-18蛋白含量。进一步地,应用蛋白免疫印迹法分别检测各组细胞中核蛋白和浆蛋白中NF-κB p65蛋白表达水平,细胞免疫荧光观察p65激活入核情况。提取MPP+干预处理的各组Bv-2细胞上清液作为条件培养基,培养小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D细胞24 h后,应用蛋白免疫印迹法检测MN9D细胞TH表达水平。动物模型以C57BL/6小鼠为对象,小鼠左侧黑质致密部立体定位注射腺相关病毒MIF-sh RNA构建MIF敲低小鼠模型。饲养28d后,通过腹腔注射MPTP（25mg/kg,一日注射4次,每次间隔2h）构建PD小鼠急性模型。实验分为生理盐水对照组、MPTP组、PBS组、AAV-con组和AAV-MIF-sh RNA组。造模完成后,采用旷场实验、爬杆实验、悬挂实验方法检测各实验小鼠PD行为学症状。分别应用酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）和离子钙接头蛋白（Ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1）免疫组化技术检测左侧黑质注射位点中多巴胺能神经元细胞数量和小胶质细胞激活活化程度。应用蛋白免疫印迹法检测小鼠左侧黑质致密部部位MIF、TH、NLRP3蛋白在小鼠黑质内表达情况。结果:（1）0.2 m M MPP+激活小胶质细胞MIF、NLRP3表达增加,并且分泌的细胞因子IL-1β和IL-18明显增加。（2）在MPP+诱导的PD体外模型中敲低MIF的小胶质细胞NLRP3表达减少,并且分泌的细胞因子IL-1β和IL-18明显减少。（3）MPP+激活的小胶质细胞NF-κB激活入核增多,且cleaved caspase-1表达增加。在MPP+诱导的PD体外模型中敲低MIF的小胶质细胞NF-κB激活入核减少,且cleaved caspase-1表达减少。（4）在MPTP诱导的小鼠模型NLRP3表达增多,抑制中脑黑质致密部MIF表达后可减少小胶质细胞的激活、降低NLRP3炎症小体表达、减轻多巴胺能神经元损伤,改善小鼠动物运动障碍。结论:PD模型存在NLRP3炎症小体激活的现象。抑制MIF表达可以减少MPP+/MPTP干预所引起的NLRP3炎症小体表达,减少小胶质细胞激活,缓解黑质多巴胺能神经元损伤,在PD的发生发展中具有神经保护作用。
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