目的:FoxP3过表达腺病毒转染小鼠骨髓源imDC可以诱导免疫耐受,产生的外泌体具有多种优点,是潜在的治疗方案。本实验采用FoxP3过表达腺病毒转染小鼠骨髓源imDC,分离其产生的外泌体,并对其进行鉴定与蛋白分析。方法:1小鼠骨髓源性imDC细胞的培养以及纯化在无菌条件下剥离小鼠股骨,细胞培养液冲出骨髓,裂解红细胞,收集剩余细胞,加入含胎牛血清和细胞刺激因子的细胞培养基培养。分别于第48h、第96h更换培养液,第6天收集细胞,计数,每10~8个细胞加入100μl CD11c免疫磁珠和400μl buffer置于4℃冰箱孵育15min,分选,收集阳性细胞。2 FoxP3过表达腺病毒转染imDC纯化的imDC离心,倒掉大部分细胞上清。按照转染复数MOI=500加入相应病毒量培养15min。以细胞浓度约10~5/ml种于24孔板中培养24h。收集细胞,洗涤,用含无外泌体胎牛血清的RPMI-1640继续培养72h。3 imDC分泌的FoxP3表达鉴定荧光显微镜动态观察细胞培养过程中FoxP3表达状况。细胞培养至72h,收集细胞,Western-blot检测细胞FoxP3表达。4 imDex分离纯化收集细胞混悬液,离心除去细胞以及细胞碎片,加外泌体提取试剂盒,混匀,室温静置12h,离心收集外泌体。5 imDex鉴定电子显微镜观察imDex形态,Western-blot检测imDex特异性标记CD63。6 imDex FoxP3蛋白分析Western-blot检测imDex FoxP3表达。结果:1 imDC形态观察细胞培养第48h:形状不规则,贴壁生长。第96h:细胞开始出现突起,集落生长。第6天:细胞有细小树突状突起,半悬浮生长,符合imDC生长形态。免疫磁珠分选后观察:细胞活力较好,绝大部分细胞具有细小树突状突起。2转染后imDC FoxP3表达鉴定荧光显微镜示:转染后第12h细胞活力良好,大部分细胞开始出现荧光,持续至第72h荧光表达呈高峰,细胞活力变差,部分死亡。转染后培养第72h,Western-blot显示:与对照组(等滴度同体积空白腺病毒)相比,FoxP3过表达腺病毒组FoxP3表达明显升高(P<0.05)。3小鼠骨髓源imDex鉴定透射电镜示:外泌体呈圆形或椭圆形,直径约为50-100nm左右,符合外泌体形态特征。Western-blot检测:外泌体特异性标志蛋白CD63呈高表达,结合形态学特征,进一步确定提取物为外泌体。4 imDex FoxP3检测结果转染后培养第72h,Western-blot显示:与对照组(等滴度同体积空白腺病毒)相比,FoxP3过表达腺病毒组产生的imDex FoxP3表达明显升高(P<0.05),证明外泌体携带imDC来源的免疫抑制因子。结论:1本实验成功利用FoxP3过表达腺病毒转染小鼠骨髓源性imDC,并检测到imDC中FoxP3高度表达。2本实验利用电镜以及Western-bolt的方法,对外泌体进行了鉴定。3本实验成功检测到FoxP3过表达imDC所产生的外泌体高表达FoxP3,证明其携带imDC的免疫调节信息。4本实验创新性利用imDex小分子可以透过血脑屏障等优点,为MS等神经免疫疾病的治疗提供了实验基础。