论文部分内容阅读
背景和目的脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是自发的非外伤性脑实质出血,占卒中的15%-20%,是最致命的卒中类型。脑出血后1年内的死亡率约为40%,只有39%的幸存者能获得功能独立。脑出血后脑损伤可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤,渗出血的质量效应和机械性破坏,无论是初始出血还是持续出血和血肿扩张,由于整体压力（颅内压升高）和局部结构的机械性压迫,都会导致直接的原发性脑损伤;炎症、细胞死亡、血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）破坏等对血肿的生理反应（主要是血肿和炎症）以及血块成分的毒性生化和代谢作用引起的继发性损伤,也会导致预后不良。早期、准确治疗继发性脑损伤对脑出血患者的预后至关重要。然而,至今尚无极有效的治疗方法。细胞死亡在脑出血继发性损伤中起重要作用。在细胞死亡的各种途径中,坏死性凋亡近年来备受关注。坏死性凋亡越来越被认为是ICH继发性损伤的最重要过程之一,可由肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）受体和Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）激活。它依赖于细胞内信号分子,包括受体相互作用蛋白激酶 1（Receptor-interacting protein kinase-1,RIPK1）、受体相互作用蛋白激酶3（Receptor-interacting protein kinase-1,RIPK3）和混合谱系激酶域样蛋白（Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL）。MLKL寡聚物的膜移位破坏细胞完整性,增加膜的渗透性,从而诱导Ca2+或Na+向内流动,导致细胞死亡。MLKL是介导坏死执行的关键分子,可能是比其他下游成分更具特异性的坏死性凋亡抑制靶点。一系列旨在抑制坏死性凋亡的药物改善了脑出血的神经损伤结果。Necrosulfonamide（NSA）是MLKL的特异性抑制剂。研究表明,NSA对脊髓损伤等疾病具有神经保护作用。NSA是否在ICH中起到保护作用尚不确定。我们假设NSA能减轻脑出血后急性脑损伤,改善神经功能恢复。为了验证这一假设,本研究利用小鼠脑出血模型,采用血肿体积测量、免疫染色、Westernblot、Evans blue染色和行为学功能测评等方法研究脑出血后炎症、神经元死亡、血脑屏障通透性和神经功能。结果,我们发现NSA在ICH急性期确实具有神经保护作用,这与NS A抑制了神经炎症和减少了坏死性凋亡有关。方法1.将108只成年（8-10周）雄性C57BL/6小鼠随机分为3组,分别为Sham组（36 只）,ICH对照组（ICH+Vehicle,36 只）,NSA治疗组（ICH+NSA,36只）,以耳标标记。2.将0.75μl（0.1 U/μl）Ⅶ型胶原酶注入ICH对照组和NSA治疗组小鼠的纹状体中制备脑出血模型,术后通过神经行为学评分判定模型是否成功;Sham组小鼠纹状体注入相同剂量的生理盐水。3.给药方法:用药组小鼠在模型制备后2小时腹腔注射NSA（剂量5 mg/kg,溶于0.25%DMSO）,之后每天给药两次直至第3天处死;ICH对照组按相同频率腹腔注射溶剂（0.25%DMSO）直至第3天处死;Sham对照组给予腹腔注射相同浓度和剂量的DMSO。4.每组小鼠均在术前及术后1、3天进行行为学测试,包括神经功能评分和转角实验。5.一般来说,脑出血后2-3天血肿旁脑组织小胶质细胞反应和中性粒细胞浸润明显,且脑出血后第3天血脑屏障破坏最为严重,所以本实验选取脑出血后第3天作为取材时间点,每组小鼠均在术后第3天处死取材。6.对脑出血后3天各组小鼠的脑损伤情况进行检测,并进行组织病理学评估。7.通过HE染色和大体切片评估脑出血后3天脑损伤面积和血肿大小。8.TUNEL和NeuN免疫荧光双染色评估脑出血后3天神经元死亡数量。9.Iba1免疫荧光染色评估脑出血后3天小胶质细胞/巨噬细胞的激活情况,MPO免疫组化染色评估脑出血后出血区域浸润的中性粒细胞数量。10.通过Western-blot检测脑出血后3天实验各组坏死性凋亡相关蛋白和连接蛋白ZO-1及促炎因子MMP-9的表达情况,坏死性凋亡相关蛋白分别为RIPK1,RIPK3 和MLKL。11.通过Evans blue染色检测脑出血后3天各组小鼠血脑屏障的通透性。结果1.HE染色和大体切片结果显示,脑出血3天后出现明显的脑损伤。经Image J分析显示,脑出血3天后,NSA治疗组的脑损伤面积和血肿体积都明显小于ICH对照组（p＜0.05,p＜0.01）,而sham组未见明显损伤。2.我们评估了NSA在脑出血后3天对神经炎症的影响。Iba1免疫染色和MPO的免疫组化染色结果分析显示,脑出血3天后,ICH对照组激活的小胶质细胞/巨噬细胞数量和血肿区域浸润的中性粒细胞数量较Sham组明显增加（p＜0.0001,p＜0.0001）,而NSA治疗组的对应细胞数量明显少于ICH对照组（p＜0.0001,p＜0.05）。促炎因子MMP-9在脑出血3天后于NSA治疗组中的表达较ICH对照组明显减少（p＜0.05）。3.应用Western blot和TUNEL/NeuN双荧光染色来判定NSA对脑出血后细胞死亡和神经元死亡的影响。WB结果显示,与Sham组相比,脑出血3天后,ICH对照组血肿周围组织的坏死性凋亡蛋白,包括RIPK1,RIPK3,和MLKL的表达量均明显增加（p＜0.05,p＜0.05,p＜0.001）;使用NSA后,与ICH对照组相比,MLKL蛋白表达明显减少（p＜0.01）,而RIPK1和RIPK3并未见明显改变（p＞0.05,p＞0.05）。另外,TUNEL和NeuN双荧光染色结果分析显示,脑出血3天后出现明显的细胞死亡（p＜0.0001）,NSA治疗组的细胞死亡数量和神经元死亡数量与ICH对照组相比明显减少（p＜0.0001,p＜0.001）。4.另一方面,WB结果显示,脑出血3天后,与Sham组相比,紧密连接蛋白ZO-1在ICH对照组中表达明显减少（p＜0.05）,而NSA用药组较ICH对照组表达显著增加（p＜0.01）。通过Evans blue染色,可以看出,ICH对照组透过的EB染液较sham明显增多（p＜0.0001）,BBB破坏严重,而经NSA治疗后的脑出血小鼠,透过的EB染液明显减少,通透性降低（p＜0.05）。5.脑出血后进行的神经功能缺损检查及行为学测试结果分析显示,脑出血1天后,ICH对照组和NSA治疗组的神经功能缺损未见明显差别（p＞0.05）,而脑出血后3天后,NSA治疗组神经功能评分较ICH对照组明显降低（p＜0.0001）,表明神经功能缺损明显改善;转角试验中,脑出血后1天,ICH对照组与NSA治疗组实验结果未有明显差别,脑出血3天后,NSA治疗组较ICH对照组明显好转（p＜0.05）。结论1.NSA可减少脑出血后脑损伤面积和血肿大小。2.NSA可通过减少小胶质细胞/巨噬细胞的激活和损伤区域中性粒细胞的浸润来抑制神经炎症反应。3.NSA可以减少脑出血后神经元坏死性凋亡的发生。4.NSA也可保护血脑屏障并改善神经功能缺损。综上说明,NSA可在小鼠脑出血急性期发挥神经保护作用。