绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫的生物防治中起着重要作用。绿僵菌侵染寄主的过程是个动态复杂的过程,但是目前仅初步阐明了金龟子绿僵菌通过分泌蛋白酶和几丁质酶等水解酶穿透寄主表皮,以及真菌侵入昆虫血腔后分泌酸性磷酸酶和海藻糖酶消耗宿主营养的机理。病原真菌致病的关键时期即侵入昆虫血腔后到寄主死亡前的时期(侵入后),这一阶段的研究还不是很清楚,但是这一阶段对真菌致病又是相当重要的。因此,本实验室构建了金龟子绿僵菌在蝗虫体内特异表达基因的差减文库,在此基础上,我们选择了蝗虫体内高表达的EST序列,编号分别为GO004730和GO004735,长度分别为565 bp和456 bp。这两个基因编码的蛋白质分别同其他真菌中的异戊烯基转移酶和α-1,2甘露糖基转移酶有很高的同源性,利用SMART技术分别获取cDNA全长;利用定量PCR分析Mpt基因的表达谱,同时利用RNAi的方法研究了Mmnt1的功能。主要研究结果如下:①获取了Mmnt1和Mpt基因的cDNA全长,并进行了生物信息学分析。Mmnt1基因cDNA全长1557bp,包括一个1296bp的开放阅读框,125bp的5’UTR,136bp的3’UTR。cDNA序列的Genbank登录号为GU990223。预测该基因编码431个氨基酸。推测含有信号肽,其序列为MVAGNARYVRYIIIAVFTLAVFYFVSNSKY,其切割位点位于AVFVSNS-KY之间。Mpt基因cDNA全长1194 bp,开放阅读框为1026 bp, 63 bp的5’UTR,105 bp的3’UTR。cDNA序列的Genbank登录号为GU271134。预测该基因编码341个氨基酸。推测信号肽序列为MAWFTGRFMAGEVAAILSAFALGYL,切割位点位于SAFALG-YL之间②利用获取的全长cDNA与绿僵菌基因组数据库比对分析获得Mmnt1和Mpt基因的DNA全长。将DNA序列与cDNA序列用bl2seq软件比对,结果表明:Mmnt1基因的DNA全长1711 bp,含有两个内含子(177bp-291bp),(1469bp-1525bp)。Mpt基因的DNA全长1380bp,含有一个内含子(862bp-937bp)。分析内含子都具有典型的GT….AG边界。③定量PCR分析Mpt基因在不同侵染时期的表达情况。定量PCR检测Mpt基因在不同侵染阶段的表达量,结果表明该基因在附着孢阶段、侵染初期以及在1/4SDA培养基的条件下,表达量都很低,相对表达量分别为17.68%,17.70%和4.85%,而侵染后期及虫体产孢时期与之相比,表达量明显增加,相对表达量为81.23%和100%。④利用RNAi的方法对Mmnt1基因的功能进行研究。干扰片段连接至RNA干扰载体(pbar-RNAi-gpd-trp)后,基因枪法转化金龟子绿僵菌CQMa102,经过PCR筛选,获得5个Mmnt1基因的干扰突变株,并用定量PCR的方法检测干扰突变株中Mmnt1基因的表达量。结果表明,干扰突变株在不同侵染时期的干扰效率在40%-80%之间。⑤对Mmnt1基因的干扰菌株进行了生物量的测定。干扰菌株和野生菌株分别接种至1/4SDA液体培养基及添加各种细胞壁破坏素的情况下,生物量结果分析表明,干扰菌株在添加KCl和H2O2的培养基上菌丝干重明显低于野生型,而在添加刚果红,荧光增白剂以及没有添加其他物质的培养基上,干扰菌株菌丝干重与野生型相比,差别不明显。⑥分析了Mmnt1基因干扰菌株在PDA培养基及添加各种细胞壁破坏素情况下的生长形态。干扰菌株和野生菌株的孢悬液分别接种于固体PDA培养上,观察其菌落形态的差别。观察结果表明,与野生型相比,干扰菌株在添加KCl和H2O2的PDA培养基上生长明显受到抑制,但在其他培养基上的生长状况和野生型相差不大。这一结果,也和生物量测结果定相一致。⑦对Mmnt1基因的干扰突变株孢子进行了了生物学毒力测定,体表接种和体内注射两种生物测定方式均显示干扰菌株的毒力降低,干扰菌株的致死时间相对于野生型均滞后一天。说明Mmnt1基因的干扰影响了孢子的毒力,据此可以推测该基因与绿僵菌的毒力是相关的。