研究背景：肾细胞癌是最常见的肾脏恶性实体肿瘤,是起源于肾实质泌尿小管上皮的恶性肿瘤。’肾细胞约占成人恶性肿瘤的2%-3%,目前临床上出现血尿、腰痛、腹部肿块的典型“肾癌三联征”的已经不到6%-10%,在肾癌患者中约30%为晚期肿瘤,大约30%的局限性肾癌患者术后出现转移；目前对于局限性肾细胞癌的主要治疗方法为手术切除,而对于那些确诊时即出现转移灶或者晚期肾癌的治疗效果并不理想,目前阶段的治疗手段包括放化疗以及免疫治疗和分子靶向治疗等。肾细胞癌中的绝大多数病理类型为肾透明细胞癌,约占60%-85%,作为腺癌的一种,其对于放疗、化疗均不敏感,而靶向药物的临床应用,明显提高了患者的生存期。目前的靶向药物如索拉菲尼、舒尼替尼等多基于选择性的抑制3或者KIT、VEGFR-1等作用于肾癌细胞的多种信号通路从而发挥抗肿瘤作用,其中最重要的通路就是Notch信号传导途径。如何提高抑制Notch通路的抑制效率是当前的研究热点,目前对于Notch通路靶向抑制多基于Notch通路受体及配体合成的抑制,而此类抑制剂对于Notch信号通路激活的三个关键位点影响有限。国外研究报道的针对Notch通路激活位点多集中于S3位点,比较有代表性的抑制剂为Y分泌酶抑制剂。ADAM-17又名TACE作为一种早期发现的TNF-α抑制剂,研究表明,在白血病中Notch1蛋白的释放依赖于ADAM-17对于Notch信号途径的作用,揭示了ADAM-17在Notch通路中的重要作用,其在Notch通路S2位点中起到了关键酶的作用。ADAM-17作为天然金属蛋白的一种,而Marimastat,是金属蛋白酶家族中唯一可抑制TACE的蛋白,Marimastat主要作用是能紧密连接基底膜,抑制TNF-α转化酶,通过稳定细胞表面TNF-α受体诱导程序性死亡。而由于其对抗TACE (ADAM-17)的作用,其通过Notch信号通路对肿瘤也引起了广泛关注。我们实验设计思路为,与ADAM-17在胞外S2位点的切割效应相比,Y分泌酶对Notch的S3位点切割位于跨膜区,跨膜区可以收到有多种信号通路的影响,由于肿瘤细胞信号通路是一个复杂的立体的结构,各信号通路有许多已知的、未知的相互影响,应用Y分泌酶抑制剂针对跨膜区Y分泌酶的作用不可避免的产生对其他信号通路的影响；而对于位于胞外区的S2位点来说,其受到影响的可能性远比S3位点要小,所以,针对S2位点的阻滞应该会有更强的具有的特异性,与Y分泌酶抑制剂相比针对ADAM-17进行抑制,在Notch通路中可以达到更好的抑制效果,对未来肾细胞癌的靶向抑制提供新的思路。研究目的：肾肿瘤的发生发展机制尚不清楚,Notch信号通路被认为在其中起到重要作用,本研究旨在研究Notch通路关键酶ADAM-17 (TACE)在肾癌组织中的表达以及Notch通路的两种抑制剂对肾癌786-0细胞以及OS-RC-2细胞增殖以及细胞侵袭影响的特异性研究方法：1、ADAM-17在肾癌组织中的表达1.1肾癌组织的提取我们收集2011年10月至2012年12月于山东大学附属省立医院泌尿微创科入住的肾肿瘤患者手术标本共67例,所有诊断由山东大学附属省立医院病理科石蜡切片确诊,同时收集癌旁正常肾脏组织共10例；手术方式为开放肾癌根治性切除术或者手助腹腔镜肾癌根治性切除术。手术患者均采用2009年AJCC的TNM分期和2004 WHO分级系统评价肾癌的临床分期,并根据临床分期进行分组。1.2肾癌组织中ADAM-17的免疫组化检测收集肾癌组织标本及正常肾脏组织标本后,选用兔抗人ADAM-17多克隆抗体,严格按照Super Polymer-二步法IHC试剂盒的方法进行脱蜡水化、抗原修复、IHC试剂盒实验、苏木精复染、DAB显色、脱水透明、显微成像系统拍照。ADAM-17阳性表达主要集中在细胞膜周围,染色为棕红色,而正常肾脏组织中肾脏细胞排列规整,无核分裂像,细胞周围无此类染色表达情况,并统计阳性例数。1.3 Western blot方法检测不同分期肾癌组织中ADAM-17的表达情况我们将收集的肾癌组织根据不同临床分期进行分组,其中临床Ⅰ期、Ⅱ期肾癌组织作为一组、ⅡI期与Ⅳ期作为一组,正常肾脏组织作为一组,不同分期肾癌组织随机抽取3例,分别提取总蛋白,肾癌组与正常肾组织组分别进行Western blot检测观察各组ADAM-17蛋白表达情况。以GAPDH作为内参照,以各组ADAM-17与GAPDH的比值表示各组ADAM-17蛋白表达水平。用扫描仪扫描胶片得到各个蛋白条带图,将得到的数据导入IPP 6.0图像处理软件,通过软件中的count/size算出各蛋白个条带的光密度值IOD(Integral OpticalDensity),然后计算各个目的蛋白条带和与之相对应的内参条带的灰度值的比。1.4流式细胞术PI单染法分析ADAM-17阳性表达的肾细胞癌组织的细胞周期根据免疫组化实验检测的结果,我们选取Ⅲ期与Ⅳ期ADAM-17 β日性表达肾细胞癌与阴性表达的肾癌组织作比较,应用PI单染法分析ADAM-17阳性表达的肾细胞癌组织中细胞周期情况。取新鲜瘤组织0.5cm3,加入PBS液适量,离心后于4℃固定12小时,再次离心,取上清,使细胞计数在1×106个/ml。取悬液50u1,加入PI100u1,染色20min以上,上机测定5×103个细胞,并用流式细胞仪检测细胞周期中G0/G1期、S期及G2/M期的细胞所占的比例。 同等条件下重复试验3次。2、抑制ADAM-17对肾癌Notch通路调控特异性的研究2.1肾癌细胞株的选择我们选取肾癌786-0细胞株以及肾癌OS-RC-2细胞株,二者均购自中国医学科学院肿瘤细胞库。两类细胞均严格按照细胞培养规程进行复苏、培养、传代以及冻存。2.2实验试剂处理及细胞分组ADAM-17抑制剂Marimastat规格lmg购自英国Tocris公司；DAPT规格5mg购自美国EMD bioscience公司。将Marimastat及DAPT试剂于常温下解冻,分别溶于DMSO中,根据体积比配置成Marimastat 1μmol/L,2μmol/L,3μmol/L以及DAPT 1μmol/L, 2μmol/L,3μmol/浓度溶液4℃冰箱保存待用。于细胞培养时各浓度试剂均取2m1加入处于对数生长期的786-0以及OS-RC-2细胞内处理24h作为实验组；对照组仅加入2m11640培养基。2.3 Western blot方法检测两类抑制剂对786-0细胞以及OS-RC-2细胞Notch通路的影响我们分别将不同浓度的Marimastat以及DAPT加入到培养中的786-0细胞以及OS-RC-2细胞中,对其Notch1、Hes-1蛋白表达进行检测,取未经处理的细胞作为对照组作比较,蛋白下降程度我们用测量的蛋白浓度-对照组蛋白浓度计算,下降程度均数±标准差表示(x±6),实验步骤参考方法1.3进行。2.4 CCK-8法检测经两类抑制剂处理后的细胞增殖情况取经过不同浓度Marimastat以及DAPT处理后的786-0细胞以及OS-RC-2细胞,均以3x105／mL的密度种于普通96孔板中,每孔加入100 μ 1细胞悬液。24h后用CCK-8法检测细胞活力。酶标仪于450nnm处检测0D值情况。下降程度以实验组数据减去对照组数据,取各组实验值的均数表示,每组实验均重复三次。同时比较两组细胞中两类抑制剂的线性相关性以及抑制程度大小。2.5 Transwell侵袭小室检测两类抑制剂对786-0细胞侵袭性的影响Transwell试剂盒购买自美国Corning公司。我们选取肾癌786-0细胞分别经1μmol/L, 2μmol/L,3μmol/L的Marimastat以及相同浓度DAPT处理,对照组不进行任何处理,经过Transwell侵袭小室实验,在400倍光学显微镜下随机5个视野观察穿过聚碳酸酯膜细胞的个数, 以均数±标准差(x±σ)表示。2.6流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染法检测两类抑制剂对786-0细胞凋亡率的影响我们将肾癌786-0细胞用1μmol/L,3μmol/L的Marimastat与DAPT进行处理,应用同体积的DMSO (15μ1)作为对照组,进行Annexin Ⅴ-PI染色后,流式细胞仪检测经不同浓度Marimastat以及DAPT处理后的786-0细胞凋亡率变化。结果判读：Modfit软件分析中我们取Q2+Q4象限被染为红色的细胞比例之和作为细胞凋亡率指标。以上同等条件下重复试验3次。2.7统计分析所有指标进行统计学处理,采用SPSS17.0软件(SPSS Inc. Chicago, IL,美国)统计软件进行分析,计量数值以x±s表示,根据需要选用配对资料的t检验或ANOVA方差分析进行统计分析,选用双侧检验。计数资料相关性检测采用χ2检验以及一元性线性回归分析,取P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.ADAM-17在肾癌组织中的表达全部67例不同分期肾细胞癌组织及正常肾组织均完成正常免疫组化程序,我们通过免疫组化染色的方法发现,在不同TNM分期肾癌组织中,ADAM-17呈高表达,全部67例中阳性表达为43例,占64.18%,而ADAM-17阴性表达者仅有24例,占35.82%,通过对上述计数资料进行统计学分析,我们得到,在肾癌组织中,ADAM-17阳性表达比例增多,差距有显著统计学意义(χ2=16.39 P<0.01)。在留取的10例肾癌旁正常的肾脏组织中,ADAM-17无一例呈表达。在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期与Ⅳ期ADAM-17阳性表达的肾癌中,进行Western blot检测,其相对光密度值分别为Ⅰ期肾癌(0.67±0.11)、Ⅱ期肾癌(0.73±0.31)、Ⅲ期肾癌(0.79±0.25)与Ⅳ期肾癌(0.89±0.09)。经统计学分析,我们可知在ADAM-17阳性表达的肾癌组织中,随着肾癌分期的增加,ADAM-17表达亦相应增加(t=18.74 P<0.01),且在Ⅳ期肾癌中的表达有着显著的增加(0.89±0.09vs 0.79±0.25)。在流式细胞术分析肾癌细胞周期中我们发现无论Ⅲ期与Ⅳ期ADAM-17阳性表达或阴性表达肾细胞癌,细胞周期处于G2期的比例均较高,为0.31 vs 0.22,说明高分期肾癌处于核分裂活跃时期,其恶性程度高；与此同时,我们比较两组G2期细胞周期数据,ADAM-17阳性表达的肾癌组织对细胞周期G2期比例有着明显上调,于ADAM-17阴性表达的肾癌组织相比,差异有显著统计学意义(χ2=20.76 P<0.01)。2.抑制ADAM-17对肾癌Notch通路调控特异性的研究我们发现于无论经过Marimastat或者DAPT处理的两类细胞,其Notch1、Hes-1蛋白表达均明显下降(P<0.05),但是,经Marimastat处理的786-0细胞,比较经过各浓度DAPT处理后Notchl蛋白、Hes-1蛋白下降更为显著；在OS-RC-2细胞中,也得到了相似的结果,我们认为,经过Marimastat处理后,肾癌细胞Notch1、Hes-1蛋白的下降程度,相比经DAPT处理后的下降程度要更大(786-0 P<0.05, OS-RC-2 P<0.05)。并且,在相同浓度(1-4μmol/L)下,经过Marimastat处理的两类细胞两种蛋白浓度比较经过DAPT处理的下降程度更大,差距有统计学意义(P<0.05 P<005)。我们在cck-8实验中发现两类细胞经过上述两种抑制剂处理后,其OD值均有明显下降,与此同时我们发现,在相同剂量下,经过Marimastat处理的786-0细胞相较于DAPT处理的细胞,OD值下降程度的更小,而相同的情况也出现在OS-RC-2细胞里,且经过统计学分析,差异与计量呈相关性(r=0.991, P<0.05, r=0.991, P<0.05)。在Transwell侵袭小室实验中,我们将786-0下拨经过两类抑制剂处理后,与对照组相比,能够穿过聚碳酸酯膜的细胞个数均有显著下降,但是,同样浓度下经Marimastat处理的786-0细胞穿过的数量更少,,差异有统计学意义(P<0.05)。应用流式细胞术观察细胞凋亡率,经过DAPT处理后786-0细胞凋亡率为3.4%,5.4%,经过Marimastat处理786-0细胞凋亡率为4.5%7.7%；对照组2.8%。经过统计学分析,经过相同浓度Marimastat处理后的786-0细胞的凋亡率要明显高于经过DAPT处理的两类细胞,二者相差有统计学意义(P<0.05)。结论：1、ADAM-17在肾癌组织中呈高表达,ADAM-17阳性表达随肿瘤分期的增加其表达相应增加2、对于高分期肾细胞癌,ADAM-17的阳性表达能上调肾癌细胞增殖,进而影响肾癌的侵袭及发展3、抑制ADAM-17表达可能成为肾癌靶向治疗的新位点4、Marimastat以及DAPT均可以降低Notch1蛋白以及Hes-1蛋白的表达,降低786-0细胞以及OS-RC-2细胞的增殖能力,在786-0细胞中可以降低癌细胞侵袭性以及提高其凋亡率5、Marimastat对于两类细胞Notch通路、细胞侵袭性以及细胞周期及凋亡率的影响比DAPT要更为显著,Marimastat对于肾癌细胞Notch通路影响以及肾癌发生发展的过程具有更好的特异性。