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目的:脑血管疾病一直被认为是全世界最常见的死亡原因之一,也是导致残疾的主要原因。脑血管疾病的60%-80%是由缺血引起的缺血性脑梗死(ischemia cerebral infarction,ICI),又称缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke)导致的。缺血性脑卒中以其持续攀升的发病率、病死率、致残率和复发率对人类的生命和健康产生严重的威胁。因此,研究缺血性脑卒中这个世界医药科学领域备受关注的重大疾病的发病机制,及时预防以及治疗其发病及并发症就显得尤为重要。此外,缺血性脑卒中也是围手术期非常严重的并发症。一旦术中发生脑灌注不足或者栓塞,都可能引起脑血流减少或中断发生缺血性脑卒中。不但严重影响患者的术后恢复,延长患者的住院及康复时间,加重患者的经济负担,还会增加医疗纠纷的潜在风险。因此,研究术中重要脏器功能保护,尤其是脑保护,对于保障患者术中生命安全,促进患者快速康复,改善预后,也具有重大意义。细胞自噬和细胞凋亡都是在缺氧诱导的缺血性脑卒中期间观察到的生物学现象。自噬在调节细胞存活状态中起着维持稳态的重要作用。许多证据表明,在缺血性卒中发生后,自噬在脑内各种细胞类型中被激活,例如神经元细胞、神经胶质细胞和脑微血管细胞等。但是,缺血性脑卒中相关的自噬过程的特定作用和分子机制尚未完全阐明。而且,自噬和凋亡之间相互转换的具体作用机制也尚不清楚。目前,关于自噬和凋亡之间的相互作用及相互调控的作用机制的研究,已经成为研究的热点问题之一,尤其是在脑缺血的发生发展和治疗中,仍需深入的研究。这将为脑缺血的防治提供新的思路,也将为临床麻醉及手术中重要器官功能的保护提供新的理论支持。UNC-51样自噬激活激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)和含有Fun14结构域的蛋白1(FUN14 Domain-containing Protein 1,FUNDC1)都参与了细胞自噬的调节。本课题研究旨在探讨ULK1和FUNDC1对缺氧诱导的神经细胞的自噬和凋亡的调控作用及其机制,以寻找抑制或减少缺血性脑卒中后神经细胞发生凋亡的可能分子靶点。方法:选取大鼠PC-12细胞在含5%CO2和90%氮气以及氧气的气体混合物的低氧箱中制备缺氧模型。在37℃缺氧条件下将PC-12细胞培养0,3,6,24小时,分别检测PC-12细胞的存活率、凋亡率、自噬及凋亡相关蛋白的表达。通过将全长ULK1序列构建到pcDNA3.1质粒(GenePharma,Shanghai,China)中对细胞进行转染来上调ULK1的表达,并标记为pc-ULK1,使用空载体pcDNA3.1作为对照。通过将含有抑制剂siRNA ULK1与Lipofectamine 3000的混合液体转染于PC-12细胞来抑制ULK1的表达。分别检测ULK1 mRNA、FUNDC1及p-FUNDC1相关蛋白的表达;PC-12细胞的凋亡率、自噬及凋亡相关蛋白的表达。将3-甲基腺嘌呤(3-MA)用作我们实验研究中的自噬的抑制剂;雷帕霉素(rapamycin)作为自噬的激活剂;SP600125作为c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂。检测在分别加入自噬抑制剂、JNK抑制剂及自噬激活剂后,JNK通路有关的关键分子的蛋白的表达。细胞存活率使用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)测定法来测定。细胞凋亡率使用膜联蛋白V-PE/7-ADD(AnnexinV-PE/7-ADD)染色测定法来测定。PC-12细胞中ULK1和FUNDC1的mRNA的表达水平使用逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)定量。使用蛋白印迹法(Western blotting)分析与细胞自噬,细胞凋亡和JNK通路有关的关键分子的蛋白表达水平。结果:通过采用CCK-8法和Annexin V-PE/7-ADD染色法来检测缺氧刺激后PC-12细胞存活率和细胞凋亡率的情况。6和24 h缺氧刺激能显著抑制PC-12细胞的活性(P<0.05和P<0.01)。缺氧处理24 h后细胞存活率降至46.29%。此外,缺氧刺激显著诱导PC-12细胞发生凋亡,并且随着缺氧时间的延长,细胞凋亡越来越严重(P<0.05或P<0.01)。在缺氧处理后3,6和24 h后细胞凋亡率分别为3.2%,7.81%和11.76%。蛋白印迹法结果显示对PC-12细胞进行缺氧处理24 h后Bax,c/p-caspase3和c/p-caspase 9的蛋白表达水平均明显增加,Bcl-2的蛋白表达水平降低(p<0.05,P<0.01或P<0.001)。这些结果表明缺氧显著诱导了PC-12细胞发生细胞凋亡。使用蛋白印迹法分析缺氧处理后低氧诱导的PC-12细胞的细胞自噬相关蛋白的蛋白表达。缺氧处理后,PC-12细胞内的LC3-II/I的蛋白表达比率和Beclin-1的蛋白表达水平上调(P<0.05;P<0.01或P<0.001)。此外,缺氧处理后p62的蛋白表达水平下调(P<0.05)。这些结果表明缺氧显着诱导PC-12细胞自噬。使用RT-qPCR定量检测缺氧诱导后PC-12细胞中ULK1和FUNDC1基因的mRNA的表达。缺氧处理明显上调PC-12细胞中ULK1基因的mRNA表达量(P<0.05或P<0.01)。缺氧诱导后PC-12细胞中FUNDC1基因的mRNA表达没有变化。然而,蛋白印迹法结果显示在缺氧刺激后PC-12细胞中ULK1基因的蛋白表达水平和p/t-FUNDC1的蛋白表达比值均增加(P<0.05或P<0.001)。这些结果表明缺氧促进了PC-12细胞中ULK1和FUNDC1基因的活化。通过将pc-ULK1和si-ULK1分别转染到PC-12细胞中以阐明ULK1基因对PC-12细胞中FUNDC1基因表达的影响。pc-ULK1转染后显著增加PC-12细胞中ULK1的mRNA表达水平(P<0.05)。用pc-ULK1转染后ULK1基因的蛋白表达水平和p/t-FUNDC1基因的蛋白表达比值均升高(P<0.01或P<0.001)。此外,siULK1转染显着降低PC-12细胞中ULK1基因的mRNA表达(P<0.01)。si-ULK1转染后显著下调PC-12细胞中ULK1基因的蛋白表达和p/t-FUNDC1基因的蛋白表达比值(P<0.01或P<0.001)。上述结果表明ULK1基因正向调节PC-12细胞中FUNDC1基因的表达。采用Annexin V-PE/7-ADD染色法和蛋白印迹法分别检测pc-ULK1(ULK1基因过表达)和si-ULK1(ULK1基因沉默)对缺氧诱导的PC-12细胞凋亡和细胞自噬的影响。在正常氧浓度条件下,pc-ULK1转染后过表达ULK1基因对PC-12细胞凋亡没有显着影响。但是,在缺氧处理后PC-12细胞的凋亡率却显著增加(P<0.01),而pc-ULK1转染后同时给予缺氧刺激PC-12细胞的凋亡率明显下降(P<0.05)。蛋白印迹法结果显示,与缺氧细胞组相比,pc-ULK1转染后再给予缺氧刺激PC-12细胞中Bax,c/p-caspase 3和c/p-caspase 9的蛋白表达降低,而Bcl-2的蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。相反,si-ULK1转染沉默ULK1基因后对正常条件下的PC-12细胞凋亡没有影响,明显加重了缺氧诱导的PC-12细胞的细胞凋亡(P<0.05)。同时蛋白印迹法的结果表明,与缺氧细胞组相比,PC-12细胞中Bax,c/p-caspase 3和c/p-caspase 9的蛋白表达增加,而Bcl-2的蛋白表达降低低氧刺激pc-ULK1转染(P<0.05或P<0.01)的。此外,pc-ULK1和si-ULK1转染对PC-12细胞的细胞自噬也没有显著的影响。与缺氧细胞组相比,缺氧+pc-ULK1组的PC-12细胞的细胞自噬增强(P<0.05或P<0.01),并在低氧+si-ULK1组中细胞自噬减少(P<0.05,P<0.01或P<0.001)的。上述结果表明ULK1参与了PC-12细胞的细胞凋亡和细胞自噬的调控。过表达ULK1基因减少了PC-12细胞的细胞凋亡并增加了细胞自噬。相关处理后通过测定JNK信号通路中关键分子的蛋白表达来分析JNK通路对ULK1过表达诱导的细胞自噬增强和细胞凋亡减少的影响。单纯缺氧处理组PC-12细胞中p/t-JNK和p/t-c-Jun的表达率显著上调(P<0.01),这表明缺氧激活了PC-12细胞中的JNK信号通路。此外,与缺氧细胞组相比,缺氧+pc-ULK1组内PC-12细胞中p/t-JNK和p/t-c-Jun的表达率增加(P<0.05)这表明pc-ULK1增强了PC-12细胞中的JNK信号通路的活化。而且,与缺氧+pc-ULK1组相比,缺氧+pc-ULK1+SP600125(JNK抑制剂)组和缺氧+pc-ULK1+3-MA(自噬抑制剂)组两组内PC-12细胞中p/t-JNK和p/t-c-Jun的表达率降低(P<0.01)的。与缺氧+pc-ULK1组相比,缺氧+pc-ULK1+SP600125组和缺氧+pc-ULK1+3-MA组两组PC-12细胞存活率降低(P<0.05)。与缺氧+pc-ULK1组相比,缺氧+pc-ULK1+SP600125组和缺氧+pc-ULK1+3-MA组两组内PC-12细胞的细胞凋亡增加(P<0.05)。这些结果表明JNK信号通路参与了ULK1基因过表达诱导的PC-12细胞凋亡的减少,而且ULK1/FUNDC1不是通过促进细胞自噬来保护细胞死亡的唯一因素。此外,与单纯缺氧细胞组相比,缺氧+雷帕霉素(自噬激活剂)组的PC-12细胞的细胞凋亡减少(P<0.05)。与缺氧+雷帕霉素+pcDNA3.1组相比,缺氧+雷帕霉素+pc-ULK1组的PC-12细胞凋亡减少(P<0.05)。这些结果进一步表明PC-12细胞缺氧后,细胞自噬适当的增强可以减少细胞凋亡。结论:ULK1/FUNDC1在缺氧诱导的神经细胞自噬和凋亡中发挥重要的调控作用,可促进细胞自噬,抑制缺氧条件下的细胞凋亡。ULK1的过表达通过促进细胞自噬可抑制神经细胞缺氧诱导的细胞凋亡。ULK1可能是缺血性脑卒中后调控细胞自噬、减少神经细胞凋亡的新的分子靶点。JNK信号通路参与了过表达ULK1基因引起的缺氧诱导的神经细胞凋亡的减少。