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维氏气单胞菌是一种常见的水产致病菌,由其引起的细菌性病害,常常会给养殖业带来不可估量的损失。因此,深入了解病原菌的遗传机理及其致病机制,对开发新型的疾病防控手段具有指导意义。近年来研究表明,核糖体拯救对病原菌恢复或维持毒力至关重要。为此,本研究以核糖体拯救因子SmpB和ArfA为研究对象,寻找可与其相互作用的肽适体,同时作用于两条主要的核糖体拯救途径,并探究其对病原宿主菌的生理生化影响,为致病机理研究提供理论基础。所获的主要研究结果如下: 首先,合成了可编码16个随机氨基酸的寡核苷酸文库。以此为模板,设计引物扩增出双链的文库DNA,并以改造的葡萄球菌核酸酶SNase为脚手架蛋白,借助两端限制性酶切位点,成功将文库DNA片段插入至SNase中,获得系列质粒pTRG-SNP。转化、筛选并随机挑取阳性克隆子测序,发现文库保持多样性,库容量可达1.5×107以上,完全符合作为一个随机文库参与肽适体的筛选。 继而,以维氏气单胞菌基因组DNA为模板,设计引物克隆了核糖体拯救因子smpB基因和arfA基因,以诱饵载体pBT为原始质粒,构建了诱饵重组质粒pBT-smpB和pBT-arfA。分析可知,基因smpB的开放式阅读框(ORF)含有489bp碱基对,编码一个含162个氨基酸的多肽,预测其分子量大约为18.6kDa,pI为9.86,三维结构模拟显示,含有3个α螺旋和7个β折叠,均与其他β或γ变形菌门该蛋白具有高度的同源性。基因arfA ORF含有240bp,编码一条大小为79个氨基酸多肽,预测其分子量大小约为9.14, pI为10.25,这与其他一些菌属的ArfA蛋白也具有较好的同源性。 其次,通过细菌双杂交系统,发现脚手架蛋白SNase可以与SmpB蛋白相互作用,同时也发现,ArfA蛋白不与SNase相互作用,但能专一性与不同氨基酸组成的16肽相互作用,从而成功的从肽适体文库中“钓取”了12条特异性的肽适体。由此提示,这些肽适体可能作用于ArfA的不同区域或位点。 最后,为了分析这些蛋白体内表达对宿主菌的生长影响,借助穿梭质粒pRE112,成功将可表达SNase和SNP的质粒pN-SN和pN-SNP转化至维氏气单胞菌中,结果发现,在25或30℃时,SNP的表达,宿主菌表现为生长减缓;42℃时,SNase或SNP的表达,表现为有助于菌体的生长。使用2.0%(w/v)KCl或10%(w/v)葡萄糖,或卡那霉素、四环素处理时,表达有SNP的维氏气单胞菌生长更加缓慢;而表达有SNase的菌株相较于空载pRE112组,对2.0%(w/v)KCl或卡那霉素较为敏感。 综上所述,本课题研究主要发现:以维氏气单胞菌核糖体拯救因子SmpB和ArfA相互作用的肽适体SNP可以作用于反式翻译途径或以ArfA介导的拯救途径。所获的研究结果为揭示两条重要的停滞核糖体拯救途径提供了新的线索,有助于开发新的小分子物质来降低病原菌的致病性,对指导病原菌新型防控具有重要意义。