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视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤,该病严重威胁患者的视力和生命。传统的治疗方法或存在应用的局限性,或存在远期毒副作用。随着肿瘤分子生物学的发展,基因治疗作为一种新的治疗策略,已越来越受到人们的重视。其中,自杀基因治疗恶性肿瘤是国内外研究的热点。本实验尝试构建肿瘤特异性双自杀基因载体pc-DNA3.1-CMV-hTERT-CDTK(pc-ChCDTK),在此基础上研究其对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体内外的杀伤作用。第一章肿瘤特异性双自杀基因载体的构建目的:构建肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK。方法:利用PCR扩增CMV增强子、hTERT启动子、yCD及TKgly 4种元件,并构建过渡载体T-CMV、T-hTERT、T-yCD、T-TKgly,连至pc-DNA3.1(-)质粒载体上构建成双自杀基因载体pc-DNA3.1-CMV-hTERT-CDTK(pc-ChCDTK);对各个元件、过渡载体及最终载体进行琼脂糖凝胶电泳、酶切和测序鉴定。结果:实验所构建的最终载体的酶切产物琼脂糖凝胶电泳所得片段大小分别为6773bp和288bp,与预期片段一致;测序证实最终载体与pc-ChCDTK序列一致。结论:成功构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK。第二章肿瘤特异性双自杀基因载体系统对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用的研究目的:研究肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用。方法:(1)CDTK在体外培养的Y79细胞中表达情况检测:将双自杀基因载体pc-ChCDTK电转染Y79细胞株。通过RT-PCR和WesternBlot的方法来确定CDTK在体外培养的细胞中表达情况。(2)双自杀基因载体系统对Y79细胞的作用:用HPLC法测定转染Y79细胞中5-Fc向5-FU转化的效率。向载体转染和未转染的Y79细胞中加入不同浓度的前体药物5-Fc(0μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml)和(或)GCV(0μg/ml,2μg/ml,4μg/ml,8μg/ml,16μg/ml,32μg/ml,64μg/ml),5天后用MTT法检测Y79细胞的平均存活率。结果:(1)双自杀基因载体pc-ChCDTK成功电转染Y79细胞:在载体转染的Y79细胞中,RT-PCR扩增出长度为403bp的特异条带,Western Blot检测见一59KD大小的条带,与CDTK基因序列分析的预期结果一致。(2)双自杀基因载体系统致Y79细胞存活率降低:转染Y79细胞中,5-Fc向5-FU转化的效率为84.5%。转染和未转染Y79细胞中加入5-Fc或GCV后平均细胞存活率均随浓度增加而降低,两组比较当5-Fc浓度达到100μg/ml、GCV浓度达到8μg/ml后各对应浓度组间均存在差异(P＜0.05)。转染组间比较,当5-Fc达200μg/ml、GCV达16μg/ml后,5-Fc+GCV组平均细胞存活率低于单加5-Fc或GCV组,有统计学差异(P＜0.05)。结论:双自杀基因载体pc-ChCDTK转染Y79细胞后,该载体在Y79细胞被转录和翻译成CDTK双自杀基因蛋白。给予5-FC、GCV达到一定浓度时,它们转化成细胞毒性物质对Y79细胞产生杀伤作用。双前体药物的杀伤作用大于单前体药物。第三章肿瘤特异性双自杀基因载体系统对裸小鼠Y79细胞皮下移植瘤杀伤作用的初步研究目的:研究肿瘤特异性双自杀基因载体系统pc-ChCDTK对视网膜母细胞瘤的体内杀伤作用。方法:(1)动物模型的建立:用G418筛选载体阳性转染的Y79细胞;通过皮下注射载体转染和未转染的Y79细胞致瘤BALB/C裸小鼠,每组10只。(2)双自杀基因载体系统对Y79皮下移植瘤的作用:Y79细胞皮下移植术7天后,向成瘤裸小鼠腹腔注射前体药物5-Fc+GCV(500mg/kg5-Fc+30mg/kgGCV),连续给药15天,每3天测量1次皮下移植瘤长径和短径,计算体积。末次给药后3天处死裸小鼠,取皮下移植瘤组织做HE染色,并提取组织RNA,用RT-PCR检测CDTK的表达。结果:未转染组裸小鼠8只成瘤,转染组裸小鼠7只成瘤。两组比较,转染组皮下移植瘤的体积较未转染组小,有统计学差异(P＜0.05);转染组瘤组织HE染色中可见散在坏死组织。转染组皮下移植瘤组织中检测到403bp片段,与CDTK预期mRNA大小一致。结论:双自杀基因载体pc-ChCDTK系统对裸小鼠的视网膜母细胞瘤皮下移植瘤的生长有抑制作用。