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目的:探讨PPARβ对成纤维细胞热损伤变性的保护作用及其作用机制。方法:1、采用体外组织细胞培养技术培养离体乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3成纤维细胞。将培养好的成纤维细胞分为热损伤组(heat injury)(52℃热水浴加热30秒)和正常对照组(normal)。于24h,48h,72h,96h不同时相点采用MTT法检测热损伤组和正常对照组细胞的生长曲线和存活率;于24h采用倒置显微镜、电镜和Western blot技术对热损伤组和正常对照组细胞的形态结构和PPARβ的表达进行比较。2、运用PPARβ shRNA质粒对乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3成纤维细胞进行RNA干扰,两种细胞各分为PPARβ shRNA组、shRNA control对照组和空白对照组;采用PPARβ特异激动剂GW0742(10-66M)干预乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞,两种细胞各分为GW0742组、DMSO对照组和空白对照组。经52℃热水浴加热30秒处理,建立成纤维细胞热损伤变性模型。于24h时相点,分别采用电镜,流式细胞技术,Western blot技术检测乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞各六组细胞热损伤变性后细胞结构,生长周期及PCNA表达,观察PPARβ对于热损伤变性成纤维细胞结构和生长增殖的影响。3、采用HSF1表达质粒转染NIH3T3成纤维细胞,建立高表达HSF1的细胞株。运用RT-PCR和Western blot技术检测NIH3T3成纤维细胞热损伤变性(52℃,30s)后PPARβ的表达。多个独立样本采用单因素方差分析,两指标间相关分析用T检验的统计学方法分析结果数据,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.采用52℃,30s热水浴损伤条件,成功诱导出乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3成纤维细胞热损伤变性模型。热损伤变性的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的生长曲线在热损伤后24h时相点达到最低值,后逐渐开始恢复。24h时相点,热损伤变性的两种成纤维细胞生存率分别为50.6%和49.6%,都有统计学意义(P<0.05)。倒置显微镜和透射电镜观察热损伤变性的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞均显示细胞胞浆出现大量空泡样物质,线粒体和内质网明显受损,两种细胞的损伤情况十分相似。乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞热损伤变性后,热损伤组PPARP的表达量与正常对照组比较均增高(P<0.05)。2.用RNA干扰技术沉默PPARβ,乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞热损伤变性后,电镜观察乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞shRNA组细胞结构破坏情况相似,结构损伤情况与对照组比较更加严重,出现胞膜和核膜的破坏,核边聚固缩的现象。流式细胞周期检测,shRNA组乳鼠真皮成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率为(76.5±1.77),NIH3T3细胞的G0/G1期细胞百分率为(77.5±0.77),分别明显高于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(50.3±2.28)、阴性对照组(50.7±1.78)和NIH3T3细胞空白对照组(50.3±0.2)、阴性对照组(50.4±1.21)(P<0.05)。乳鼠真皮成纤维细胞的G2/M、S期细胞百分率为(7.8±1.23和13.6±0.84),NIH3T3细胞的G2/M、S期细胞百分率为(9.2±1.13和12.8±1.84),分别低于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(12.5±2.07和36.5±2.38)、阴性对照组(13.0±0.67和36.1±1.46)和NIH3T3细胞空白对照组(16.3±0.39和31.8±1.38)、阴性对照组(16.6±0.39和33.8±2.32)(P<0.05)。 shRNA组乳鼠真皮成纤维细胞增殖指数(0.22),NIH3T3细胞增殖指数(0.22),分别明显低于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(0.49)、阴性对照组(0.49)和NIH3T3细胞空白对照组(0.49)、阴性对照组(0.50)(P<0.05)。 Western blot显示,shPNA组的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的PNCA表达量与对照组比较分别降低了61.5%和52.7%(P<0.05)。3.采用特异性激动剂GW0742激动PPARβ,乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞热损伤变性后,电镜观察乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞GW0742组细胞损伤情况十分相似,细胞结构与对照组相比更为完整,胞浆内空泡结构减少,核仁清晰。流式细胞周期检测,GW0742组乳鼠真皮成纤维细胞的G0/G1期细胞百分率为(38.5±3.06), NIH3T3细胞的G0/G1期细胞百分率为(40.1±3.27),分别明显低于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(50.4±1.43)、阴性对照组(50.2±2.15)和NIH3T3细胞空白对照组(56.4±1.43)、阴性对照组(56.2士2.15)(P<0.05)。乳鼠真皮成纤维细胞的G2/M、S期细胞百分率为(21.3士1.57和42.8±1.38),NIH3T3细胞的G2/M、S期细胞百分率为(16.8±3.17和44.3±1.15),分别高于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(10.8±2.56和38.7±2.29)、阴性对照组(10.5±1.26和38.4±1.49)和NIH3T3细胞空白对照组(10.7±2.56和31.6±2.29)、阴性对照组(11.5士1.26和33.4±1.49)(P<0.05)。GW0742组乳鼠真皮成纤维细胞增殖指数(0.62),NIH3T3细胞增殖指数(0.61),分别明显高于乳鼠真皮成纤维细胞空白对照组(0.50)、阴性对照组(0.49)和NIH3T3细胞空白对照组(0.42)、阴性对照组(0.42)(P<0.05)。Western blot显示,GW0742组的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的PNCA表达量与对照组比较分别增加了67.7%和47.3%(P<0.05)。4.上调表达HSF1的NIH3T3细胞遭受热损伤后,采用RT-PCR和Western blot显示PPARβ的表达量均增加(P<0.05)。结论:1.采用52℃,30s热水浴成功诱导离体鼠类成纤维细胞热损伤模型。热损伤变性的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的细胞结构和生长情况相似:胞浆结构损伤严重,胞核未见明显损伤,24h时相点成纤维细胞生长增殖减低最严重,后逐渐恢复正常,生存率明显降低。热损伤乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞均显示PPARβ的表达量增高。2. shRNA组乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞结构损伤更为严重,处于分裂期的细胞百分比降低,处于静止期细胞百分比增高,增殖能力降低。而GW0742组乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞经热损伤变性后,细胞结构损伤比较对照组细胞减弱,处于分裂期的细胞百分比增高,增殖能力提高。PPARβ对热损伤变性的乳鼠真皮成纤维细胞和NIH3T3细胞的结构和生长增殖具有保护作用。3.转染HSF1的NIH3T3成纤维细胞热损伤变性后,该细胞PPARβ的表达上调,初步证实HSF1通过上调PPARβ而对热损伤变性后成纤维细胞发挥保护作用。