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精子发生是一个有着严格时空特异性调控的生物学过程。该过程主要分为三个时期,有丝分裂期(精原细胞增殖和分化)、减数分裂期(精母细胞染色体减半)和精子形成期(精细胞变形)。从原始生殖细胞分化为成熟的精子,主要受到下丘脑-垂体-睾丸轴分泌的激素及生长因子的调控,与此同时,松果腺对雄性动物的生殖也起着重要的调控作用。褪黑素的分泌主要来自松果体细胞,通过特异性膜受体和非受体介导,影响神经激素以及睾酮的分泌,从而参与了睾丸的发育调控。mi RNAs是一类非编码小RNA,通过与非编码区(以3’UTR为主)结合,在转录后水平及翻译水平实现对基因表达的调控。一系列的条件性敲除试验证实,mi RNAs对睾丸功能以及精子发生起着重要的调控作用。高通量测序结果也表明,不同发育阶段的生殖细胞以及初情期前不同阶段的睾丸中,mi RNAs的表达图谱呈现出显著差异。因此,mi RNAs被认为参与了生殖细胞和睾丸的发育调控。本课题组前期的研究结果表明,褪黑素改变了小鼠睾丸中mi RNAs的表达图谱,mi RNAs生成过程中相关基因的表达显著上调。但褪黑素是否通过调控mi RNAs参与了精子发生及其相关作用机制,目前仍没有报道。本试验中,以小鼠精原细胞系GC-1 spg为模型,运用高通量测序、基因过表达和干扰等技术,初步探讨了褪黑素-mi RNA-m RNA对GC-1 spg细胞增殖和凋亡的影响以及相关信号通路,为进一步认识褪黑素对精子发生的影响及其分子调控机制提供新的依据。主要研究内容及结果如下:1)0.01-1μM褪黑素显著提高了GC-1spg的细胞活力并改变了mi RNAs和m RNAs的表达图谱。10-8 M褪黑素处理组中有176条mi RNAs差异表达,其中,171条mi RNAs表达量上调,5条mi RNAs表达量下调;m RNA测序结果显示,与对照组相比,褪黑素处理组中有28个基因呈现出表达差异,其中,11个基因的表达水平上调,17个基因的表达水平下调。2)褪黑素/mi R-223对GC-1spg细胞增殖和凋亡的影响。10-8 M褪黑素显著降低了GC-1spg细胞中mi R-223的表达量;50 n M mi R-223 mimics转染GC-1spg细胞,显著降低了Mt2,Ccnd1和Ccne1的表达,显著抑制了细胞的增殖并促进了细胞的凋亡;100 n M mi R-223 inhibitor转染GC-1spg细胞,提高了Mt2,Ccnd1和Ccne1的表达并降低了GC-1spg细胞中低线粒体膜电位细胞的比例。3)mi R-223/Mt2对GC-1spg细胞增殖和凋亡的影响。荧光素酶报告基因活性检测证实Mt2为mi R-223的靶基因。GC-1spg细胞中Mt2基因过表达,促进了周期蛋白基因Ccna2、Ccnb1、Ccne2,周期蛋白依赖性激酶Cdk4、Cdk6以及细胞增殖标志基因和抗凋亡基因Pcna和Bcl2的表达;反之,干扰Mt2基因在GC-1spg细胞中的表达,则降低了这些基因的表达。Mt2基因过表达,显著促进了GC-1spg细胞的增殖并抑制了凋亡;而干扰Mt2基因的表达,则显著抑制了GC-1spg细胞的增殖并促进了凋亡。4)褪黑素激活了GC-1 spg细胞中ERK1/2信号通路。10-8 M褪黑素提高了ERK1/2的磷酸化水平。PD98059(MEK抑制剂)阻滞了褪黑素对GC-1 spg细胞中Mt2基因的促表达作用和促增殖作用,并加剧了细胞的凋亡。综上所述,本实验表明褪黑素改变了GC-1spg细胞mi RNAs和m RNAs的表达图谱。mi R-223/Mt2介导了褪黑素对GC-1spg的促增殖作用。ERK1/2信号通路参与了褪黑素对GC-1spg的促增殖调控。本研究为进一步认识褪黑素参与精子发生调控的机理提供了新的理论依据,也为少精不育症的治疗提供了新的思路。