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背景与目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）和肝癌（Hepatocellular cancer,HCC）是世界上常见的恶性肿瘤,在中国发病率和死亡率均很高。膜联蛋白A2（Annexin A2,ANXA2）在多种肿瘤组织高表达,促进肿瘤的恶性发展特质如癌细胞增殖及侵袭转移强化等。研究发现ANXA2也在CRC和HCC中高表达,ANXA2在CRC的发展过程中可能是一个关键性基因表达异化事件之一,而且可能存在一条ANXA2信号通路。ANXA2在29.5%的被调查CRC病例中高表达,并且与肿瘤生长和转移侵袭等密切相关。ANXA2活化是其发挥信号转导作用的基础,文献表明ANXA2活化的重要功能域位于其N末端,但是,其N端关键性氨基酸位点在肿瘤发生、发展过程中的作用机制报道极少。进一步深入研究ANXA2蛋白N端关键位点对理解其信号通路调节及其与肿瘤发生发展的关系具有重要意义。在前期构建的ANXA2人结直肠癌敲除细胞系（ANXA2-/-caco2）的基础之上,我们以单点突变（Site directed mutation）和多点突变（Multiple sites directed mutation）技术构建了其N端有关关键位点单点、多点突变子表达载体,将这些突变子在ANXA2-/-caco2细胞表达,探究ANXA2 N端关键位点突变对细胞恶性表型和行为的调节作用,从而评价ANXA2的分子构效与肿瘤细胞恶性度的关系。同时,预测了与ANXA2可能有靶向关系的miRNAs,选出可以最高分值结合到ANXA2 3,UTR 的 3 个 miRNAs（miR-1-3p、miR-206 和 miR-613）,以双荧光素酶报告基因技术证明miR-206与ANXA2靶向关系最好,随后进一步研究了miR-206对caco2细胞恶性表型和行为的调控。HCC发病隐匿,手术治愈率低,化疗效果和预后不理想。目前广泛采用的脂质体阿霉素（Lipo-DOX）为临床常用的广谱抗癌一线化疗药物,但Lipo-DOX缺乏靶向性,药物的毒副作用仍然很大,并伴随快速形成的多药抗药性（Mutiple drug resistance,MDR）。所以,目前肿瘤临床化疗面临两大瓶颈问题:即药物的靶向性不足和MDR形成。这两大瓶颈问题导致了癌症化疗效果不佳、副作用巨大、复发转移率和病人死亡率居高不下。因此,研发具有足够肿瘤靶向性,同时可以抑制甚至逆转MDR的抗癌新药迫在眉睫。我们前期筛选获得的特异、敏感靶向HCC的12肽HCSP4,具有良好的HCC细胞/组织结合特异性和敏感性,同时结合文献及数据库分析预测,发现miR-101在HCC表达极低,并可能靶向ANXA2及MDR相关基因,具有抑制对化疗药物MDR的潜力。在上述ANXA2在CRC发生发展中信号通路调节的研究基础上,以HCSP4和miR-101为药物靶向和MDR抑制元件,制备了 HCSP4-Lipo-DOX-miR101肝癌靶向药物递送体系,对该体系的体外（本室其他研究生课题）、体内HCC靶向、抗MDR作用进行研究,同时对ANXA2基因表达在该载药体系的体内治疗过程中可能的作用进行了分析。研究方法:1.借助 cBio Cancer Genomics Portal 和 GEPIA 等数据库,分析 ANXA2 在 CRC和HCC临床样本中的变异情况以及在其临床发展中的作用。2.以结肠癌和肝癌临床组织和组织芯片为材料,利用免疫荧光法,研究ANXA2的表达水平变化。3.设计构建ANXA2 N端各关键位点单点、多点突变子表达载体,转染ANXA2-/-caco2 细胞。4.以 ANXA2+/+caco2、ANXA2-/-caco2和转染 NM 质粒的 ANXA2-/-caco2为对照组,以分别转染 S1、S11、S25、Y23、S1-Y23、S11-Y23 和 S25-Y23 的ANXA2-/-caco2为实验组,采用MTT、损伤修复、Transwell、流式细胞术、免疫荧光染色等方法,检测ANXA2 N端关键位点对caco2细胞增殖、周期、运动、凋亡、细胞整体骨架以及与运动相关微结构的影响。5.通过权威网站预测与ANXA2有靶向关系的miRNAs并以双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系。6.将miR-206表达载体转入野生型caco2细胞,检测ANXA2被抑制率、肿瘤细胞有关行为、形态的指标及EMT相关基因表达水平。7.通过ANXA2及MDR相关基因靶向分析,设计构建miR-101表达载体。8.采用薄膜超声分散法制备脂质体,硫酸铵pH梯度法载药,利用阳离子脂质体带正电荷的特性,与带负电的DNA,即miR-101表达载体,加载miR-101质粒,制备 HCSP4-Lipo-DOX-miR101。9.应用荧光分光光度计、激光粒度仪、扫描电镜和透射电镜等检测HCSP4-Lipo-DOX-miR1 01的特性及药物包封率。10.优化HCSP4-Lipo-DOX-miR101的转染效率并评估其靶向性。11.建立HCC移植瘤裸鼠模型,并通过HCSP4-Lipo-DOX和HCSP4-Lipo-DOX-miR101给药（尾静脉注射）处理,从肿瘤生长曲线、肿瘤体积、肿瘤重量、肿瘤的肺转移及ANXA2在裸鼠移植瘤中的表达等方面综合评估HCSP4-Lipo-DOX-miR101的体内治疗效果。研究结果:1.ANXA2的表达与结肠癌恶性程度高度相关,尤其在低分化腺癌T3N0Mx期高表达,与大数据分析结果高度吻合。2.ANXA2的表达与肝癌恶性程度高度相关,尤其在中-低分化肝细胞癌高表达,与大数据分析结果高度吻合。3.ANXA2 N端各关键位点突变能够不同程度抑制ANXA2的激活水平。4.ANXA2 N端各关键位点突变能够不同程度抑制caco2细胞的恶性行为。5.ANXA2的N端各关键位点突变能够重塑caco2细胞的运动相关微结构。6.miR-206、miR-1-3p 和 miR-613 均能够靶向 ANXA2,且 miR-206 对其靶向关系最好。7.miR-206通过靶向ANXA2,负调控ANXA2表达。8.体外过表达miR-206抑制caco2细胞的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡,抑制肿瘤EMT发生。9.成功构建HCSP4-Lipo-DOX-miR101肝癌靶向药物递送体系,特性良好。10.HCSP4-Lipo-DOX-miR101具有较高的转染效率,对HepG2细胞具有良好的靶向性,并抑制ANXA2表达。11.HCSP4-Lipo-DOX-miR101抑制裸鼠体内移植瘤生长,尤其是在耐药细胞株HepG2/ADR中,并能够抑制裸鼠移植瘤中ANXA2的表达。研究结论:1.ANXA2的表达与结肠癌和肝癌的恶性程度高度相关。2.ANXA2的表达及其N端4个关键位点,尤其是Y23对于维持caco2细胞的恶性表型至关重要。3.miR-206靶向ANXA2并负调控其表达,体外过表达miR-206抑制caco2细胞的恶性表型。4.HCSP4-Lipo-DOX-miR101具有明显的HCC体内靶向治疗效果和MDR抑制特性,其作用机制与miR-101对ANXA2的表达抑制密切相关。