【摘 要】
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柑橘黄龙病(Huanglongbing)是一种毁灭性病害,对全球柑橘产业造成巨大威胁。柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama)不仅是柑橘上的一种重要害虫,也是柑橘黄龙病的重要媒介昆虫。当前化学农药滥用导致严重的昆虫抗药性和生态环境被破坏,通过生物防治控制柑橘木虱是绿色植保的未来趋势。本文通过分离鉴定分析了柑橘木虱可培养内生细菌的多样性,比较了柑橘木虱感染黄龙病菌后的内生菌群结
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柑橘黄龙病(Huanglongbing)是一种毁灭性病害,对全球柑橘产业造成巨大威胁。柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama)不仅是柑橘上的一种重要害虫,也是柑橘黄龙病的重要媒介昆虫。当前化学农药滥用导致严重的昆虫抗药性和生态环境被破坏,通过生物防治控制柑橘木虱是绿色植保的未来趋势。本文通过分离鉴定分析了柑橘木虱可培养内生细菌的多样性,比较了柑橘木虱感染黄龙病菌后的内生菌群结构组成及变化,筛选出对柑橘木虱具有较强致病力的虫生真菌,分析了球孢白僵菌(Beauveria bassiana)侵染柑橘木虱过程的转录组数据,筛选、鉴定了柑橘木虱抵御外来真菌侵染的免疫相关基因。本文的主要研究结果如下:(1)明确了广东省8个地区柑橘木虱可培养内生菌群的多样性,共分离保存了柑橘木虱内生细菌菌株114株,归类为细菌界的3个门的15个属。结果表明,不同地区柑橘木虱的可培养内生菌多样性差异较小。明确了柑橘木虱可培养细菌的优势菌群,包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、泛菌属(Pantoea)等,其中芽孢杆菌属细菌59株占分离的内生细菌总数的51.75%,假单胞属细菌14株占分离的内生细菌总数的12.28%,泛菌属细菌10株占分离的内生细菌总数的8.77%。菌株聚类分析表明,59株芽孢杆菌属细菌归为4个大类,分别是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)。(2)明确了柑橘木虱感染黄龙病菌后的菌群结构组成及变化,黄龙病菌的侵染深度改变了柑橘木虱体内微生物结构和组成,微生物的总体数量和种类都有大幅度降低。感染黄龙病菌后,柑橘木虱中放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)等8个优势门的相对比例显著降低,仅有变形菌门(Proteobacteria)的相对比例显著增加。从属的水平上来看,感染黄龙病前后柑橘木虱内生菌群的相对丰度发生较为显著的变化,大多数优势菌群的相对丰度有所降低,而沃尔巴克氏体属(Wolbachia)的相对丰度却从1.80%提高到2.15%,Carsonella属的相对丰度没有显著变化(34.90%vs.34.84%)。(3)从罹病柑橘木虱上共计分离到57株真菌,筛选到侵染柑橘木虱的虫生真菌10株,其中2株对柑橘木虱具有较强的致死效果,分别是宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)和球孢白僵菌,接种柑橘木虱7 d后致死率分别为81.25%和95.70%。比较研究了宛氏拟青霉与球孢白僵菌对柑橘木虱的致病力,并将菌株对柑橘木虱的时间效应和剂量效应统一到时间-剂量-死亡率模型中,研究结果显示两个菌株均具备研制成生物制剂的潜能。宛氏拟青霉侵染柑橘木虱是在中国的首次报道。(4)利用二代高通量Illumina Miseq测序技术首次完成了感染球孢白僵菌24 h、48 h、72 h与健康柑橘木虱的转录组测序,对筛选到的差异表达基因进行功能注释、分类以及参与的信号通路分析。在CK vs.S24h、CK vs.S48h和CK vs.S72h三个转录组里分别获得了971、1671和752个显著差异表达基因(DEGs),GO富集分析表明分别有405、614和542个DEGs显著富集到56、83和60个GO terms中,KEGG pathway分析结果显示分别有98、333和247个DEGs显著富集到10、27和25个代谢通路里。差异表达基因主要富集在能量代谢、离子运输、转录和翻译调控、生殖和发育调控以及免疫防御反应等相关通路,大部分编码潜在的与免疫识别及调控相关的基因。(5)通过基因序列比对、结构域分析、系统进化树构建等生物信息学方法,筛选出柑橘木虱体内免疫相关基因,共鉴定了80个免疫相关基因,其中包括21个免疫识别基因、12个信号转导基因、39个调制器基因和8个效应分子基因。利用q RT-PCR测定了15个免疫相关基因随时间变化的相对表达量,研究结果显示免疫相关基因在柑橘木虱抵御外来真菌侵染的过程中发挥着重要作用。
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