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甜叶菊是一种原产于南美洲原始森林的多年生菊科草本植物,作为林产植物饮料资源已有一千多年安全食用历史。甜菊糖苷是从甜叶菊叶片中提取出来的天然高倍甜味成分。由于具有纯天然、高甜度、极低热量、安全性高和稳定性好等特点,甜菊糖苷被誉为“第三代健康糖源”和“最佳天然甜味剂”。在甜菊糖苷诸多组分中,莱鲍迪苷M（Reb M）因口感最接近于白砂糖而受到广泛关注,但由于在甜菊叶中Reb M含量很低,导致用传统提取分离方法生产成本高昂。随着合成生物学在二十一世纪的迅速发展,天然产物的微生物异源合成研究不断取得进展,高值甜菊糖苷组分的定向催化合成研究也逐渐成为关注热点。甲壳素是地球上蕴藏量仅次于纤维素的第二大天然高分子聚合物,生物质材料壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物。壳聚糖分子侧链富含氨基和羟基等配位基团,较易进行化学修饰、改性和赋予多种功能,具有优异的生物相容性和生物可降解性,绿色安全,环境友好,是理想的酶的固定化材料。本论文通过优化糖基转移酶的体外基因表达,以甜菊提取物重要成分莱鲍迪苷A（Reb A）为原料,以壳聚糖小球为酶的载体,对固定化糖基转移酶和共固定化糖基转移酶定向催化Reb A生成Reb D和Reb M进行了系统研究。通过酶的固定化提高了定向催化效率,为高值甜菊糖苷组分的生物催化转化提供了新的策略和技术支撑,具有重要的理论意义和工业化应用价值。本文主要研究内容如下:通过糖基转移酶OsEUGT11和SrUGT76G1在大肠杆菌中胞内表达优化、纯化及生化特性分析实验,获得了高效糖基转移酶的表达及优化的催化条件。确定了大肠杆菌BL21（DE3）（pET28a-OsEUGT11）和 BL21（DE3）（pET28a-SrUGT76G1）表达糖基转移酶OsEUGT11 和 SrUGT76G1 的最优条件,分别为 25℃、0.1mM IPTG 诱导 12 h 和 18℃、0.1mM IPTG诱导16 h。以UDPG为糖基供体时,OsEUGT11的粗酶液能催化Reb A生成Reb D,Reb A的转化率达95%以上,Reb D的生成率达到105.8%;SrUGT76G1的粗酶液能催化Reb D生成Reb M,Reb D的转化率为87.5%,Reb M的生成率达到101%。利用重组酶上的6His标签,纯化了重组糖基转移酶OsEUGT1 1和SrUGT76G1。比较了糖基转移酶OsEUGT1 1和SrUGT76G1在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达、纯化等特性,选择在大肠杆菌中表达的糖基转移酶OsEUGT1 1和SrUGT76G1用于固定化研究。建立了固定化糖基转移酶OsEUGT11（UGT1）和SrUGT76G1（UGT2）的固定化体系及催化体系。以壳聚糖为固定化载体,用戊二醛交联的方法,将在大肠杆菌中表达并纯化后的糖基转移酶UGT1和UGT2固定到壳聚糖小球的表面,制备了固定化糖基转移酶,成功地催化Reb A生成Reb D,催化Reb D生成Reb M。以浓度为4%（m/v）的壳聚糖溶液制备了直径约为2.0 mm、表面积约为12.56 mm2的壳聚糖小球,从交联剂浓度、交联反应时间和酶载量三个维度对壳聚糖小球固定化糖基转移酶的条件进行了实验优化,获得的最佳戊二醛交联浓度为0.1%（v/v）,最佳固定化时间为8 h,0.2 g壳聚糖小球上糖基转移酶的最佳载量为0.05 mg。对固定化糖基转移酶UGT1和UGT2的酶反应动力学参数进行了优化和分析。结果表明,固定化糖基转移酶UGT1和UGT2的最佳反应温度都是37℃,最佳pH值均为7.0,固定化UGT1的催化速率高于UGT2,固定化UGT2与底物之间亲和力更大,固定化UGT1的催化效率高于固定化UGT2。固定化酶UGT1和UGT2可重复使用,均表现出较好的稳定性。4次和8次重复使用后,固定化UGT1分别保持了 60.6%和48.5%的相对活性,固定化UGT2分别保持了 52.6%和38.2%的相对活性。固定化UGT1比固定化UGT2具有更高的稳定性。在上述研究的基础上,建立了混合固定化酶级联催化Reb A生成Reb M和共固定化酶级联催化Reb A生成Reb M的反应系统。混合固定化糖基转移酶催化体系中UGT1和UGT2的最佳比例为1:10,UDPG与Reb A的最佳比例为1:3.5。混合固定化酶循环使用5次后活性为原始酶活性的43%。确定了共固定化糖基转移酶催化体系中UGT1和UGT2的最佳比例为1:10,UDPG与Reb A的最佳比例为1:3,最佳反应温度是37℃,最适pH值为7.0。Reb A投料浓度为5g/L的时候,底物转化率为97.3%,Reb M产率为72.2%。比较了共固定化和混合固定化UGTs催化底物Reb A生产Reb M的产率,通过共固定化酶UGTs的催化可将87.1%的Reb A进行转化,比混合固定化UGTs高了 1.7倍;双酶共固定化体系Reb M产率为75.4%,是混合固定化体系Reb M产率的3.2倍,这些结果表明共固定化体系有更高的催化效率。评测了双酶共固定化系统的重复使用稳定性,在使用4次和8次之后,共固定化酶活力分别保持在原来的72.5%和53.1%,说明共固定化酶体系具有较高的稳定性,并可以通过多次使用降低酶的总成本,为工业化高效生物级联催化合成Reb M提供了理论依据和技术支持。