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植物生长发育的许多过程都受到泛素-蛋白酶体途径的调控。泛素-蛋白酶体途径(UPP)是真核生物体内蛋白质选择性降解最为重要的途径,包括两个连续的过程：泛素化系统通过泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的级联反应将泛素或多聚泛肽链连接到它的底物上；26S蛋白酶体降解泛素化蛋白。据估计拟南芥基因组编码1300多种E3连接酶,其中36%的E3连接酶属于RING结构域蛋白。对这类蛋白基因的研究刚刚起步,目前报道的十几种RING型E3连接酶通过泛素介导的蛋白质降解参与植物光形态建成、配子体发育、花发育、种子发育、激素的信号转导、抗逆、抗虫等方面的调控。大豆(Glycine max(L.)Merrill)是重要的植物蛋白与食用植物油的来源,但其生长发育常受到低温、干旱和高盐等逆境的胁迫。植物对各种胁迫会产生一系列的应答反应,其中泛素-蛋白酶体途径(UPP)发挥着重要的调控作用。本研究从大豆中首次克隆了RING蛋白基因GmRFP1,发现它的表达受到逆境胁迫的影响,进一步对GmRFP1的功能做了分析。GmRFP1的克隆与功能研究对于大豆抗逆育种具有重要意义。本研究主要取得了以下研究进展：1.通过RT-PCR和RACE技术从大豆中克隆得到RING蛋白基因,命名为GmRFP1, GenBank注册号为EU786799。序列分析表明GmRFP1全长1671bp,包括1179bp的完整ORF,编码392个氨基酸残基。蛋白结构分析发现存在一个N端跨膜区和RING保守结构域。同源比对结果显示GmRFP1蛋白与其它物种的同源蛋白在RING结构域的一致率超过83.3%。为了分析GmRFP1基因的时空表达模式,本研究采用半定量RT-PCR方法检测了GmRFP1在根、茎、茎尖、叶、花和种子中的表达,发现GmRFP1基因为组成性表达;荧光定量RT-PCR结果显示GmRFP1的表达水平受低温、高盐、干旱胁迫以及ABA的影响：ABA和高盐能诱导GmRFP1的表达；而在冷和干旱胁迫下表达量呈下降的趋势,表明GmRFP1是ABA和冷、干旱、盐胁迫应答基因。2.为了分析GmRFP1的蛋白功能,本研究构建了原核表达载体pGEX4T-2/GmRFPl,同时针对RING结构域的活性位点构建了突变体,造成该结构域中两个保守半胱氨酸发生改变。两种融合蛋白都在大肠杆菌中得到表达,纯化后进行体外泛素连接酶活性检测,发现GmRFP1融合蛋白能够进行自主多聚泛素化反应,而突变体蛋白则不能发生反应。该实验表明GmRFP1蛋白具有E3泛素连接酶活性,并且RING结构域的保守半胱氨酸对于其E3泛素连接酶活性是必需的,半胱氨酸的突变造成了E3连接酶活性的丧失。3.进一步构建了GmRFP1基因的正义和反义表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草,获得了过量表达GmRFP1基因和反义抑制GmRFP1基因表达的转基因烟草植株；对转基因植株的逆境适应能力和ABA反应进行了分析,发现过量表达GmRFP1基因使转基因植株对ABA反应敏感性降低,生长快,根长,侧根多,对低温的耐受能力也减弱；抑制GmRFP1基因表达的转基因植株则提高了对低温的耐受能力,提示GmRFP1可能是ABA信号通路和低温胁迫应答信号途径的负调节因子。4.为了探讨GmRFP1调控低温胁迫信号通路的可能机制,应用蛋白质组学方法对野生型烟草、过量表达的转基因烟草及抑制表达的转基因烟草叶片的差异表达进行了研究,鉴定出6个表达量变化2倍以上的蛋白,即膜联蛋白VCaB42,硫氧还蛋白H1、核糖体蛋白、葡萄糖-6磷酸脱氢酶、成熟酶K和转录延长因子GreA;发现GmRFP1的抑制表达上调了低温胁迫信号途径相关的膜联蛋白VCaB42.硫氧还蛋白H、核糖体蛋白和葡萄糖-6磷酸脱氢酶的表达量,这可能是反义GmRFP1转基因烟草抗寒力增强的原因。4.从大豆中克隆了两个泛素结合酶E2基因,分别命名为GmUBCc571和GmUBCc171。序列分析结果表明,它们的cDNA开放阅读框长度均为447bp,编码148个氨基酸,中部第85位是决定E2s活性的半胱氨酸残基。表达谱分析表明GmUBCc571只在茎、茎尖、叶、花中表达,在根和种子中不表达；而GmUBCc171呈组成性表达。通过实时定量RT-PCR发现在ABA处理和低温、高盐胁迫条件下,GmUBCc571都存在两次mRNA的积累过程,PEG胁迫下mRNA表达呈现升高的趋势；GmUBCc171的表达不受ABA的诱导,而PEG和低温胁迫诱导了它的表达,高盐条件下存在两次mRNA的积累过程。为了检测GmUBCc571和GmUBCc171蛋白的泛素结合酶活性以及它们能否与GmRFP1 E3泛素连接酶发生相互作用,本研究构建了GmUBCcs原核表达载体,表达纯化了GmUBCc571和GmUBCcl71重组蛋白。Western blot检测发现GmUBCc571和GmUBCc171融合蛋白具有E2泛素结合酶活性,且在体外能够与GmRFP1 E3泛素连接酶发生相互作用。