番茄lncRNA39042与PI100的克隆及其抗病作用

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番茄(Solanum lycopersicum)原产于南美洲,由于其果实营养丰富,具有特殊风味,在中国广泛栽培。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是发生在番茄上最严重的病害,为了防止降低产量,在分子水平上对此病进行防治尤为重要。植物体内起自我保护作用蛋白质的合成与积累,可直接抑制病原物的生长,这类抗性蛋白质如病程相关蛋白(Pathogenesis Related Protein,PR),在其表达时,会受到长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的调控。lncRNA是一类长度大于200 nt,不具备编码蛋白能力的线型RNA片段,目前,已有研究揭示其与植物病害相关,但关于植物中影响PR-6即蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor,PI)功能相关的lncRNA未见报导。本研究围绕上述问题进行科学探究,具体过程和实验结果如下:首先,本研究筛选出晚疫病相关的SLPI100(S.lycopersicum Protease Inhibitor 100)及位于其反义链上的lncRNA39042,二者均存在于番茄10号染色体上且含有响应生物胁迫的启动子元件;从番茄叶片中分别克隆出lncRNA39042及SLPI100基因片段,长度为310 bp与285 bp,SLPI100的半衰期30 h、平均疏水性0.189、理论等电点9.38、相对分子量10.52 kD、为疏水性蛋白,具有PI功能结构域,属于马铃薯蛋白酶抑制剂I家族。其次,lncRNA39042及SLPI100分别在番茄的叶和根中表达量最高,推测其在抗土传病害和叶部病害过程中发挥重要功能;在致病疫霉菌的侵染下,二者的相对表达量呈现先升高后下降的趋势,表明其能够很好地响应致病疫霉的侵染;随后成功获得了lncRNA39042与SLPI100基因的克隆载体以及过表达载体;在通过体外sgRNA活性检测后,构建lncRNA39042的CRISPR-Cas9双靶点载体。最后,获得根癌农杆菌工程菌株,并分别建立番茄同源和烟草异源瞬时表达体系,与转化pBI121质粒的对照组相比,在过表达lncRNA39042和SLPI100基因的番茄叶片中,番茄呈现抗病表型,PR表达量显著升高,在烟草中呈现相似的趋势;而lncRNA39042的敲除番茄叶片中,番茄易感病,PR显著下调,表明lncRNA39042与SLPI100基因能够在番茄与致病疫霉互作的过程中发挥抗病作用。本研究通过生物信息学分析结合生物学实验的方法,初步探究了lncRNA39042与SLPI100基因在植物与病原物互作中的抗性,不仅为lncRNA与PI基因作用机制的研究奠定基础,同时为其他植物的抗病功能研究提供依据。
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