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亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)从普通野生稻(Oryza rufipogon)驯化而来,在驯化过程中,亚洲栽培稻亚种间的遗传多样性逐渐降低。而且,由于水稻育种过程中一些性状优异的品种被反复利用,使得栽培稻亚种间的遗传多样性变得更加狭窄。遗传多样性的下降,不仅使亚洲栽培稻对病虫害的抗性下降,更限制了籼粳亚种间杂种优势的利用,使得水稻产量难以取得更大的突破。与亚洲栽培稻具有相似AA基因组的野生稻,普遍具有更强的对病虫害的抗性和环境适应能力。其中,长雄野生稻是产自非洲的多年生野生稻,具有许多优良的性状,是栽培稻的改良的优异基因库。然而,长雄野生稻和亚洲栽培稻种间存在严重的生殖隔离,这对长雄野生稻优异基因的利用是一个巨大的障碍。因此,必须克隆更多的杂种不育基因,阐明其遗传机理,进而打破这种生殖隔离。本研究以泰国籼稻品种RD23为轮回亲本,长雄野生稻为供体亲本构建了一个近等基因系(NIL)。杂种F1(RD23/NIL)的育性(花粉半不育和小穗低育)受一对杂合基因座位(暂时命名为S40)控制。本文的主要结论如下:1.杂种F1(RD23/NIL-S40)在开花后,表现花药开裂存在障碍。比较亲本RD23、NIL-S40和F1花粉在柱头上的附着和萌发以及花粉管在子房中的延伸,发现杂种F1柱头上附着的花粉数量明显比RD23少,附着花粉粒的柱头上可以观察到花粉的萌发和花粉管的延伸。以RD23为母本,杂种F1为父本,进行辅助授粉,RD23的结实率比授以其自身花粉时的结实率明显下降,表明F1花药开裂的异常影响结实率。I2-KI染色和花粉离体萌发实验表明,杂种F1中大概一半的花粉粒不能积累淀粉,因此也没有萌发的能力。醋酸洋红和DAPI染色观察花粉发育过程,发现杂种F1花粉败育发生在二胞花粉早期,原因是部分小孢子不能进行第一次有丝分裂,而且花粉壁发育异常,内壁缺失。但是杂种F1的花药壁都能正常形成而且绒F能的降解也无明显缺陷。此外,以杂种F1为母本,RD23为父本进行饱和授粉,杂种F1的结实率并没有恢复到正常水平,说明F1雌配子发育也存在异常。为了确定杂种F1胚囊败育发生的时期,用胚囊整体透明染色方法观察亲本RD23和杂种F1雌配子的发育过程。结果发现,杂种F1的雌配子能够进行减数分裂,并形成四个大孢子,但是这四个大孢子中,靠近珠孔端的三个大孢子在单核胚囊时期没有发生降解,靠近合点端的大孢子也不能进一步发育,形成功能大孢子。没有形成功能大孢子的胚囊无法进行之后的三次有丝分裂,最终败育。对成熟胚囊进行育性统计发现,F1的胚囊表现为半不育。这些结果表明,杂种F1小穗低育的表型是由胚囊的半不育和花药开裂障碍共同导致的。2.构建了两套 BC1F1群体(RD23/NIL-S40//RD23;RD23//RD23/NIL-S40)检测雌配子和雄配子的传递率。利用与S40位点紧密连锁的分子标记,对这两个群体的每个单株进行基因型检测,结合花粉育性和小穗育性进行分析,结果表明RD23作为母本,授以RD23/NIL-S40的花粉时,回交群体中,可育单株(S40iS40i)与不育单株(S40iS40l)的比率符合1:1的分离比;以杂种F1(RD23/NIL-S40)作为母本,授以RD23的花粉时,回交群体中可育单株(S40iS40i)与不育单株(S40iS40l)的比率也符合1:1的分离比。这说明杂种F1(S40iS0l)中,不管是携带S40i型(RD23)还是S40l型(长雄野生稻)的雌雄配子都能正常传递。这种遗传模式符合“单位点孢子体不育模型”。3.通过连锁分析,将S40连锁到第1染色体短臂17.3 cM的区间内,随后利用202个单株的F2(RD23/NIL-S40)群体,将S40初定位在分子标记Z116和HLY43之间的1.3 Mb区间内。最后利用总共16600个单株的F2(RD23/NIL-S40)群体,将S40位点精细定位在分子标记ES-2和ES-60之间,与其分别有1个和3个交换单株。基于已经测序的93-11序列,该区间的物理距离约为80 kb。通过重要交换单株F2:3群体分子标记和表型(花粉育性和小穗育性)的鉴定,验证了该区间的可靠性。通过测序分析发现,RD23和长雄野生稻在该区间的物理距离也是约80 kb。4.利用Gramene(http://www.gramene.org/)对80 kb区间进行基因预测,发现其包含8个开放阅读框(ORF1-ORF8)。通过对这些基因的表达模式和测序分析,发现ORF2、ORF6和ORF7的氨基酸序列在RD23和NIL-S40中没有差异。虽然ORF3和ORF4的氨基酸序列在RD23和NIL-S40中存在差异,但是这两个基因在花药或者雌蕊中的表达量很低。因此这些基因都不太可能是S40的候选基因。ORF5编码一个在雌蕊中特异表达的类泛素蛋白酶ulp1,RD23-ORF5的氨基酸序列在第189位氧基酸是天冬氨酸(Asp,D),而在NIL-S40中被替换成天冬酰胺(Asn,N)。ORF8编码一个R2R3型MYB转录因子,主要在花药中表达;RD23-ORF8的氨基酸序列在第236-237位氨基酸之间比NIL-S40少了一个丙氨酸(Ala,A)。因此我们将ORF5和ORF8暂定为S40位点的候选基因。