恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一。目前治疗肿瘤的方法主要有手术、放射、药物和免疫疗法。化学药物治疗是肿瘤治疗中发展最快的一个领域，在肿瘤的治疗中发挥着越来越大的作用。然而，化疗药物的毒副反应及肿瘤细胞对药物的抗药性严重影响了化学治疗的效果。因此，寻找高效低毒的新型抗癌药物是当务之急。 在长期的抗癌药物筛选实践中人们发现，从植物中开发新的抗肿瘤药物具有极大的潜力。近几十年来，研究者们发现了多种重要的抗肿瘤天然产物，如长春碱、长春新碱、紫杉醇、鬼臼毒素及其衍生物等。目前临床上用于治疗肿瘤的植物药已筛选出二十余种，分别为生物碱类(如长春碱类、三尖杉酯碱类、喜树碱类等)、木脂素类(如鬼臼毒素半合成衍生物)、柄型大环化合物(如美登木素)、二萜类化合物(如紫杉醇、雷公藤内酯及冬凌草甲素等)。从作用机制来看，这些植物药分别作用于微管系统，如长春碱类及紫杉醇；或作用于拓扑异构酶，如喜树碱类及鬼臼毒素衍生物；有的则通过影响核糖体功能阻止蛋白质合成，如三尖杉酯碱类。 在上述各类抗肿瘤植物药中，木脂素类化合物以其显著的生物活性引起了广泛关注。木脂素是一类由苯丙素双分子氧化聚合而成的天然产物，广泛存在于多种高等植物的根、茎、叶、种子和果实中。木脂素的生物活性广泛而显著，主要包括：抗肿瘤作用、肝脏保护和抗氧化作用、抗微生物作用、抗炎及免疫调节作用、血小板活化因子(PAF)拮抗活性以及PKC抑制活性、抗焦虑作用等。在各种类型的木脂素中，苯并呋喃类木脂素占据着重要地位，这类木脂素均含有苯并呋喃结构骨架，具有多种生理活性，如抗增殖、抗血管生成、抗血栓、抗氧化以及心血管方面的活性。大量的研究发现，许多天然或合成的苯并呋喃类木脂素都具有显著的抗肿瘤活性，且抗肿瘤活性与干扰细胞内微管蛋白的聚合与解聚活性有关。 微管(microtubule)是存在于所有真核细胞中，由微管蛋白(tubulin)装配、聚合而成的长管状细胞器结构，能与其它蛋白共同组装成纤毛、鞭毛、轴突、神经管、基粒、中心粒、纺锤体等结构，参与细胞骨架的构成、细胞形态的维持、细胞收缩、伪足运动、细胞内物质运输以及细胞分裂等。在GTP、Mg<2+>及微管相关蛋白(MAP)等存在时，微管依赖于微管蛋白二聚体对其不停地结合与分离而处于一种装配与去装配的动态平衡中，即聚合一解聚的动态平衡。在有丝分裂过程中，当细胞由分裂间期进入有丝分裂前期后，细胞质中的微管迅速解聚并重组为纺锤体，纺锤体微管附着于染色单体的着丝粒，参与染色单体的分离。分裂进入末期后，纺锤体又解聚装配成微管。由此可见，为行使正常的微管功能，微管处于动态的装配和解聚状态是非常重要的。 微管与纺锤体之间的互变是细胞分裂的重要环节。抗微管化合物均能干扰这一环节，影响微管的正常功能，引起有丝分裂阻滞，并通过一系列的信号传导诱导细胞凋亡。与正常细胞相比较，分裂增殖旺盛的肿瘤细胞对这种干扰作用更加敏感。因此，作用于微管，干扰细胞有丝分裂的化合物，都有可能开发成为抗肿瘤药物。能够干扰微管功能的苯并呋喃类木脂素因而具有良好的开发前景，值得深入研究。中山大学化学化工学院综合分析了大量天然苯并呋喃木脂素的结构与活性，在此基础上设计合成了一系列带有不同取代基的2-芳基苯并呋喃类木脂素，拟对其抗肿瘤活性及构效关系进行研究，期望筛选出具有良好活性的化合物。本研究共筛选了14个苯并呋喃化合物，发现化合物：ERJT-12具有明显的体外抗增殖作用及抗微管作用，并探讨了其作用的分子机制。 方法与结果：1．2-芳基苯并呋喃类木脂素化合物的体外抗增殖活性 方法：取对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板，每种化合物均设不同浓度的用药组及相应的溶剂对照组。MTT法检测每孔OD值，Bliss法计算半数抑制浓度(IC<,50>值)。 结果：在所筛选的14种化合物中，化合物ERJT-12的细胞毒作用最强；ERJT-18和ERJT-30的细胞毒性较ERJT-12稍弱；ERJT-06、ERJT-16、ERJT-26、ERJT-28呈现轻度的细胞毒作用；化合物ERJT-09、ERJT-21、ERJT-23、ERJT-29的细胞毒作用不明显。化合物PJY-02、PJY-04和ERJT-01溶解度较差，对上述3种肿瘤细胞的．IC<5o>值未能检测。 进一步检测化合物ERJT-12对多种人肿瘤细胞的体外抗增殖作用。结果显示：人乳腺癌细胞MCF-7、人口腔上皮癌细胞KB-3-1对化合物ERJT-12比较敏感，IC<,50>值分别为5.75±O.38uM、6.75±O.68μM；人肺腺癌细胞GLC82和人膀胱癌细胞ECV-304对ERJT-12的敏感性较低，IC<,50>值分别为15.18±1.56 μM、17.29±1.64μM。 化合物ERJT-12对多药抗药细胞也具有明显的生长抑制作用。对KB一3-1细胞(敏感株)的IC<,5o>值为6.75±0.68 uM，对C-A120细胞(阿霉素275倍耐药株)的IC<,50>值为8.87±O.66μM，耐药倍数为1.3倍；ERJ-12对CCRF-CEM细胞(敏感株)的．IC<,50>值为8.82±0.37μM，对CCRF—VCRl000细胞(长春新碱8123倍耐药株)的IC<,50>值为13.75±1.69μM，耐药倍数为1.6倍。 2．ERJT-12对MCF-7细胞周期及相关的细胞周期调控蛋白的影响 2．1．流式细胞仪检测细胞周期分布 方法：收集不同浓度ERJT-12处理的MCF-7细胞，PBS洗涤，70％乙醇固定。离心悬浮细胞于PBS，溴化丙啶(PI)染色后，流式细胞仪检测DNA含量，LYSIS软件分析。 结果：不同剂量ERJT-12分别作用MCF-7细胞24h后，细胞出现不同程度的G<,2>/M期阻滞，呈剂量依赖性。同时，各处理组G<,1>期细胞所占比例呈剂量依赖性下降，S期细胞比例无明显改变。 2.2.Western blot法检测细胞周期调控蛋白的表达情况 方法：不同浓度的ERJT-12处理MCF-7细胞24h后制备蛋白样品，定量。每泳道加等量样品后开始聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规转印及封闭，分别标记一抗、二抗，暗室中曝光、冲片。 结果：不同剂量ERJT-12分别处理MCF-7细胞24h后，Cdc25c总蛋白的表达无明显改变，而Ser-216(216位丝氨酸)磷酸化的Cdc25c的表达则呈剂量依赖性上调，即失活状态的Cdc25c增多；相同作用条件下，CDKl总蛋白的表达无明显改变，而Thrl4/Tlyrl5(14位苏氨酸/15位酪氨酸)磷酸化的CDKl表达则呈上调趋势，即未被激活的CDKl增加；CyclinBl蛋白的表达随处理剂量的增加而下调。 3．ERJT-12诱导有丝分裂阻滞及对微管蛋白聚合的影响 3.1.Giemsa染色观察有丝分裂阻滞 3.2.比色法检测微管蛋白聚合活性 结果：ERJT-12能够抑制微管蛋白的聚合，其抑制作用与秋水仙碱类似，且随剂量增加抑制作用增强。 3.3．细胞免疫荧光实验 方法：细胞经固定、透化处理后封闭，依次与抗微管蛋白抗体及相应FITC标记的二抗孵育一定时间，荧光显微镜下观察。 结果：ERJT-12处理组细胞微管的改变与秋水仙素组类似，微管趋向于解聚，在胞浆中的密度降低。 4．化合物ERJT-12诱导MCF-7细胞凋亡及机理研究 4.1．流式细胞仪检测细胞凋亡 4.2．DNA梯形条带检测 4.3．Caspase-3、Caspase-6活性检测 4.4．Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax蛋白的磷酸化状态及表达情况 [结论] 1.14个全新合成的苯并呋喃木脂素化合物中，4-位甲酰基取代的化合物 ERJT-12细胞毒作用最明显，对体外培养的多种人肿瘤细胞均有不同程度的生长抑制作用，对乳腺癌MCF-7细胞的抗增殖作用最显著；ERJT-12对多药抗药的人口腔上皮癌细胞C-A120和淋巴细胞白血病细胞CCRF-VCRl000有较明显的细胞毒作用，与抗癌药物ADM、VCR和VP-16之间没有明显的 交叉抗药性。 2．ERJT-12能够诱导MCF-7细胞出现明显的G<,2>/M期阻滞，呈剂量依赖性。阻滞作用的原因可能是使G<,2>/M期调控蛋白Cdc25c磷酸化失活，同时下调CyclinBl蛋白的表达，导致G<,2>/M期转换的关键分子CDKl无法激活。 3．ERJT-12能够抑制微管蛋白的聚合，作用类似于秋水仙碱，从而干扰纺锤体的功能，诱导MCF-7细胞阻滞于有丝分裂期。 4．ERJT-12能以剂量依赖性和时间依赖性关系诱导MCF-7细胞凋亡。凋亡的诱发因素可能是G<,2>期和M期的双重阻滞，导致细胞出现不可逆的损伤。Caspase家族成员和Bcl-2家族成员参与了ERJT-12诱导的凋亡。直接执行 凋亡功能的Caspase-3和Caspase-6明显激活，Bax蛋白上调，Bcl-2蛋白磷酸化失活，均有利于凋亡的发生。 5．化合物ERJT-12有希望开发成为作用于微管的抗肿瘤药物。