论文部分内容阅读
发光菌是指能够以长链脂肪醛、分子氧和还原型黄素单核苷酸为底物，在荧光素酶的催化作用下，产生波长约为450-490nm蓝绿光的一类细菌。发光菌的发光强度和细胞的代谢活性直接相关，当发光菌处于毒性环境中时，细胞的代谢活性下降，同时发光强度下降，因此发光强度的变化能够准确快速地反应环境毒性，这就是发光菌应用于生物毒性分析的理论基础。大部分发光菌生长发光依赖高盐环境，发光测试时需要加入3%的氯化钠，对毒性的测试可能形成干扰；因此生长不依赖海洋环境的青海弧菌Q67（Vibrio qinghaiensis，以下简称Q67），在生物毒性测定领域获得了广泛认可。目前青海弧菌发光机制的研究较少，为了能够充分了解青海弧菌Q67的luxCDABE基因，推进其在食品、生物膜、生命科学等领域的应用，本试验通过扩增得到了Q67luxCDABE基因、16S rDNA基因；对荧光素酶氨基酸序列、16S rDNA碱基序列进行了系统发育学分析；对lux基因编码的荧光素酶α、β亚基，脂肪酸还原酶、转移酶、合成酶的理化性质、二级结构、三级结构进行了预测；构建了重组质粒，原核表达luxAB、luxCDABE基因，并测定了发光表达量。研究取得以下主要结果：（1）扩增得到了16S rDNA基因片段，经测序得到了1520bp的碱基序列。系统发育学分析发现Q6716S rDNA序列和Vibrio ordalii、 Vibrio anguillarum最相似，可以确定Q67属于弧菌属。（2）获得了5766bp完整的luxCDABE碱基序列，还有一小部分luxG。结合试验及文献记载，可以推断青海弧菌的lux系统除了核心元件luxCDABE之外，应该还包括luxR、luxI、luxG。（3）通过NCBI Blast和ORF处理，最终得到了luxC、luxD、luxA、luxB、luxE基因的开放阅读框，大小分别为1446bp、954bp、1143bp、975bp和1155bp。对lux基因编码的氨基酸序列进行理化性质预测，发现五种蛋白的理论等电点集中在5.0-6.2之间；除luxA编码的荧光素酶α亚基较为稳定外，其他蛋白的稳定性不强；LuxCDABE基因编码的蛋白疏水系数均为负值，说明这些蛋白偏亲水性。对荧光素酶（luxAB编码）氨基酸序列进行系统发育学分析，生物进化树分析发现Q67的荧光素酶基因和V. choleraebiovar albensis有着较近的亲缘关系。（4） LuxAB、 luxCDABE基因通过构建重组质粒，成功转化了大肠杆菌TOP10，获得了T-PluxAB、T-PluxCDABE两种重组菌，并实现了原核表达。T-PluxCDABE在不加癸醛测试时最大发光值为13，T-PluxAB在不加癸醛的情况下不能发光。加入癸醛、排除代谢产物干扰，利用IPTG诱导等方法能提升重组菌的发光特性。