长牡蛎SNP标记开发及其在家系分析和物种鉴定中的应用

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长牡蛎又称太平洋牡蛎,属软体动物门、瓣鳃纲、珍珠贝目、牡蛎科、巨蛎属,广泛分布于中国,韩国和日本的沿海,是一种广温、广盐性的内湾贝类。它是世界上最重要的海水养殖贝类之一,也是我国目前重要的海水养殖主导种类。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)是当前最具潜力的分子遗传标记,遍布整个基因组,具有密度高,共显性,能稳定遗传且易自动化检测的优点,是研究遗传学和基因组学的理想分子标记。目前,利用EST数据库来进行突变位点的筛查是开发SNP标记的重要途径。高分辨率熔解曲线(Highresolution melting, HRM)是一种高效的突变筛查与基因分型技术,具有简单、精确及低成本等特点。本研究利用HRM技术开发长牡蛎EST-SNP标记,并对SNP在家系分析和物种鉴定中的应用进行了探讨,为今后牡蛎的高密度遗传图谱构建,种群结构分析,生物多样性保护和分子标记辅助育种等遗传学研究提供了基础资料。1.长牡蛎SNP标记的开发通过检索EST序列库,经过进一步的人工比对筛选,得到5781个EST簇和48796个候选SNP位点。随机挑选150个候选SNP设计引物,通过HRM分析方法,在一个野生长牡蛎群体中对其进行验证和分型。实验结果表明,有55个候选SNP位点显示出多态性:观测杂合度Ho的分布区间为0.063至0.560,平均值为0.284;期望杂合度He的分布区间为0.091至0.448,平均值为0.279;多态信息含量PIC从0.059-0.371,平均值为0.231;在不同亲本情况下,55个多态性位点用于家系鉴定的累积排除能力大于99.99%。2.长牡蛎SNP标记在家系分析中的应用分析55个SNP在六个长牡蛎家系中的遗传模式,结果显示有48个位点在至少一个家系中表现出多态性,呈现遗传分离;没有发现无效等位基因。在各家系中呈现分离的位点数分别为26,21,27,20,19,19。经卡方检验后,在各家系中符合孟德尔遗传分离比的位点数分别为22(84.6%),19(90.5%),16(59.3%),15(75.0%),15(78.9%),和15(79.0%),其余位点显著偏离孟德尔遗传分离比(P<0.0.5)。检验SNP位点的家系鉴定能力,模拟结果表明使用30个多态性SNP位点,家系鉴定成功率为46%,而真实的家系鉴定成功率仅为17%;当SNP位点数增加到40时,模拟值与真实鉴定的成功率都为100%;模拟结果显示多态性SNP的累计鉴定成功率随着亲本数的增加而明显降低。家系鉴定结果表明需要较多的SNP来抵消多态性低带来的负面效果以达到稳定性较好的鉴定成功率。3. SNP标记在巨蛎属近缘物种鉴定中的应用基于五种巨蛎属牡蛎(长牡蛎,葡萄牙牡蛎,近江牡蛎,香港巨牡蛎和熊本牡蛎)的线粒体16S rRNA筛选出一对引物,利用HRM分析平台直观地显示出条形码序列由SNP引起的Tm值差异,从而达到了区分物种的目的。
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