论文部分内容阅读
本文在对虎颜花的地理分布和种群状况进行较详细调查的基础上,开展其种子的萌发特性研究,从生境状况、群落特征和种子萌发方面阐述虎颜花的濒危原因;开展种子无菌播种研究,繁育大量虎颜花实生苗,为下一步自然回归提供足够的材料;开展虎颜花小规模的再引入试验,为下一步种群重建奠定基础;开展叶片的组织培养研究,建立优良株系的再生体系,获得大量种苗来满足商品化生产的需要;开展虎颜花微卫星引物开发的初步研究,为虎颜花遗传多样性分析奠定基础。主要研究结果如下:
1.虎颜花的分布和群落特征。对虎颜花野生资源的调查发现,虎颜花斑块状分布于广东省境内的云开大山和云雾山脉,北纬21°55'~22°24',东经111°10'~111°48'的区域内,垂直分布在海拔50m~1000m之间。虎颜花现存的种群数量很少,种群规模也较小。虎颜花对生境要求严格,只生于林下溪边或水沟边的石壁或岩石积土上,喜荫蔽潮湿的环境,光照强度为3~23μmol·m-2.s-1,湿度在70%以上。虎颜花群落中伴生的维管束植物有146种,没有特定的伴生植物。虎颜花是草本层的优势种,但其幼苗数量很少,种群自我更新能力较弱。光照和湿度可能是影响虎颜花分布的主要因素。
2.虎颜花种子萌发特性。探讨了温度、光照、植物生长调节剂(GA、6-BA)和含氮化合物(NaNO3、NaNO2)对虎颜花种子萌发的影响,试验结果显示:在交替光照下(12h光照,12h黑暗,1200Lx),在22~26℃范围内,温度变化对虎颜花种子的最终萌发率和萌发速率影响不大,但温度降低会延长萌发时间。黑暗条件下,种子萌发率为零,添加交替光照后,萌发迅速。在1Lx~2000Lx的光强下种子均能萌发;随光强增大,萌发率升高;在1200Lx的光强下种子萌发率最高,可达76.67%,650Lx、1200Lx和2000Lx的光强对种子萌发的效应没有显著性差异。不同浓度的GA、6-BA、NaNO3和NaNO2都不能代替光照诱导种子在黑暗下萌发,光照是影响虎颜花种子萌发的关键因素。将虎颜花种子播种在泥炭土和水稻田土两种基质上,在温室中萌发率均可达70%以上,没有显著差异,但两种基质上幼苗生长缓慢,成苗率均较低。种子贮藏1年以上,萌发率和萌发速率会显著下降。
3.虎颜花种子的无菌播种和试管育苗。试验发现:适宜种子萌发和成苗的培养基为添加0.1mg·l-1NAA的MS培养基;播种30d后萌发率为60.6%,75d后成苗率为53.5%;适合壮苗培养的培养基是添加1.0mg·l-1NAA的MS培养基;幼苗移栽到泥炭:河沙:蛭石(1:1:1,V/V/V)的混合基质上,覆膜遮荫培养,成活率可达98.77%。
4.虎颜花的生长特性和栽培观察。3~5月和9~10月为虎颜花生长旺盛期,新叶发生和生长迅速。虎颜花植株一年长出新叶15片左右,平均叶数10.3。栽培1年以上的植株可开花,花期为11月,但未见结果。虎颜花易在高温干旱条件下出现焦叶现象。主要虫害有蜗牛,蛞蝓等食叶害虫。
5.虎颜花的再引入试验。将通过无菌萌发得到的虎颜花实生苗,再引入到阳春市圭岗镇河坪村和鹅凰嶂自然保护区。回归苗的成活率为50%左右,回归苗和野生苗生长情况没有明显的差异。
6.虎颜花的组织培养。以30d叶片为外植体,在0.1%HgC12溶液中浸泡6min,成活率达67.78%。不定芽诱导的最佳培养基是添加2.0mg.l-16-BA、0.1mg.l-1TDZ的MS培养基,40天后诱导率为88%,每个外植体平均出芽数为7.6;不定芽增殖的最佳培养基为2.0mg.l-16-BA、0.5mg.l-1NAA的MS培养基,增殖系数为5.7;最佳生根培养基为添加0.5mg·l-1IBA的1/2MS培养基。采用河沙:泥炭土:蛭石(1:1:1;v/v/v),覆膜遮荫栽培,成活率可达95%以上。
7.虎颜花微卫星引物开发。以野生虎颜花植株为材料,利用磁珠富集法,从142个转化子中获得21个阳性克隆,对其进行测序分析,获得16个虎颜花微卫星序列,微卫星序列富集的效率为11.3%,PCR扩增筛选效率为76.2%。用PrimerPremier5.0设计了13对微卫星特异引物,筛选得到10对有效引物,可以进行下一步多态性筛选。