抑郁症是最常见的心境障碍,其发病率甚高,约15-17%,近年来更是呈逐年上升的趋势。据世界卫生组织提供的数据,目前全世界范围内有3.4亿抑郁症患者,且每年有1000-2000万的患者有自杀倾向,预计到2020年,抑郁症将成为第二大致残因素,是21世纪人类的主要杀手。此外,抑郁症也给家庭和社会带来沉重的经济和精神心理负担,严重阻碍经济的发展和社会的和谐稳定。因此,抑郁症的防治是当今医学科学研究的重大课题。目前虽已有众多有效的药物或心理救助等治疗抑郁症的方法,如5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制剂、三环类抗抑郁药物以及电疗(ECT)等都具有较好的疗效；但并非所有的患者都能得到有效的救助,事实上,临床上只有不足50%的患者得到了有益的治疗。其原因主要有：第一,现行的抗抑郁药物起效慢,需治疗几周甚至几个月方可有效,而患者往往很难坚持到取得疗效便放弃治疗；第二,在长期的药物治疗期间,抑郁症的复发率非常高,而且约有35%的患者对目前的抗抑郁药物不敏感。第三,治疗的费用高,特别是新药更是昂贵,患者难以承负长期的治疗；特别是我国目前使用的抗抑郁药物多半是进口的,患者的经济负担更大。第四,严重的药物副作用,比如,性功能丧失、妄想等。因此,寻找起效快、副作用少、效果好且费用低的新抗抑郁药物或方法成为当务之急。近年来,神经科学的研究成果为抑郁症的治疗带来了革命性的进展。大量的研究表明,抗抑郁药的疗效与成年海马脑神经元再生密切相关。长期的抗抑郁治疗可以促进成年海马神经元再生,通过促进该区的神经元再生可以逆转或阻止抑郁症引起的大脑尤其是海马结构及功能的损伤,并具有抗抑郁的效果；而当该区神经再生被阻断时,抗抑郁药的疗效也会随之消失。另外,作为抑郁症发生最为可能病因的不同类型应激均可导致成年海马新生神经元数目显著减少。因此,成年中枢神经系统海马区的神经再生在抑郁症的治疗中具有重要的作用,以促成年海马神经元再生作为抗抑郁治疗新靶标无疑是一个抑郁症研究的新视角和新策略,有望成为更有效、更快捷的新型抗抑郁药物筛选方法。基于上述假设,我们首先筛选具有促进成年海马神经元再生的药物,然后通过行为学、药理学、分子生物学等手段来检测其是否具有抗抑郁作用,并探索其作用机制。本研究共分三部分,第一部分为促成年海马神经元再生的中药成分筛选。实验采用8-11周龄的成年C57BL/6J雄性小鼠,候选的中药单体或组分如下：附子多糖(FPS)、芍药苷(PF)、石杉碱甲(Huperzine A)、蛇床子素(Osthole)、升麻里提取的阿克特素(Actein)和升麻醇木糖甙(B8)、马钱子粗提物(nux vomica extract)、马钱子生物碱粗提物(nux vomica alkaloids extract)、去掉马钱子碱和士的宁的马钱子生物碱(SubstanceⅠ)、去生物碱马钱子乙醇析出物(SubstanceⅡ)、去生物碱马钱子乙醇溶解物(SubstanceⅢ)。以腹腔注射或灌胃的方式给予候选药物,10 min后腹腔注射BrdU标记新生的神经细胞,通过检测海马颗粒细胞层下缘(SGZ) BrdU阳性细胞数目的方法,初步筛选出具有促进成年海马神经元再生潜力的药物。结果发现：1、FPS能显著增加成年海马SGZ中BrdU阳性细胞数(F=3.479,P=0.008),且在100 mg/kg的浓度时效果最显著,与对照组相比增加了64.5%(P<0.001)；2、PF处理的成年小鼠SGZ中的BrdU数目较对照组显著增加(F=8.755,P=0.003),并呈剂量依赖性。3、在石衫碱甲处理的成年小鼠中,只有0.5mg/kg剂量组与对照组相比有显著差异(P<0.05),且增加的幅度高达83.5%；4、与对照组相比,蛇床子素处理小鼠的SGZ中BrdU数目没有统计学差异(F=1.066,P=0.420)；5、升麻里提取的两成分中,阿克特素显著增加了成年海马SGZ中BrdU的阳性细胞数(P<0.05),但另一成分B8与对照组相比则无统计学差异(P>0.05)；6、马钱子提取的五个组分,与对照组相比,对成年海马SGZ中BrdU阳性细胞数均无影响。总之,通过本实验,我们筛选出FPS、PF、石杉碱甲、阿克特素四种药物能显著增加成年海马SGZ中BrdU阳性细胞数,提示这四种药物具有可以促进成年海马神经元再生的潜力。第二部分,FPS促成年海马神经元再生及其抗抑郁作用研究。1、FPS促进成年海马神经元再生的作用：首先,将FPS分为5 mg/kg到400 mg/kg共6个剂量组,分别对成年C57BL/6J小鼠进行单次腹腔注射,间隔10min再给予BrdU(75 mg/kg)腹腔注射一次,24小时后经心脏穿刺灌注固定,取脑进行BrdU免疫组化染色,光镜下计算海马SGZ中BrdU阳性细胞数目。结果发现FPS从10 mg/kg到400 mg/kg五个剂量组均能显著增加SGZ中BrdU阳性细胞数(F=3.479,P=0.008),且100 mg/kg剂量组效果最明显(P<0.001),提示FPS可促进成年海马神经元的增殖；另外,连续给予FPS(100 mg/kg)腹腔注射7天,在最后两天腹腔注射BrdU(75 mg/kg),每天4次,每次时间间隔为2小时,BrdU注射后28天处死动物,取脑做BrdU/NeuN免疫荧光双标记,分别在激光共聚焦显微镜、荧光显微镜下观察,记录BrdU阳性细胞数目和NeuN与BrdU共染色的细胞(NeuN+/BrdU+)数目,计算NeuN+/BrdU+占BrdU阳性细胞的百分比。结果发现附子多糖能显著增加SGZ中NeuN+/BrdU+的细胞数目(P<0.05)以及NeuN+/BrdU+细胞数占总BrdU+细胞中的比例(P<0.05),提示附子多糖促增殖的新生细胞中大部分向着神经元的方向分化。因此,附子多糖具有促进成年海马神经元再生的作用。2、FPS的抗抑郁作用：首先,单次腹腔注射FPS(100mg/kg),30分钟后行强迫游泳实验(FST)和旷场实验,我们发现FPS能显著缩短C57BL/6J小鼠的不动时间(Immobility) (F=4.279, P=0.010),而对其自发活动能力并无影响(F=0.413,P=0.744)；其次,连续腹腔注射FPS (100 mg/kg) 7天,24小时后进行新环境进食抑制实验(NSF)检测,结果发现FPS能缩短C57BL/6J小鼠的进食潜伏期(t=3.286,P=0.005),而在随后的5分钟食物消耗检测中,FPS处理组与对照组相比并无统计学差异(t=0.180,P=0.860),表明潜伏期的缩短非食欲差异原因。再次,在社会失败(social defeat)应激动物模型的基础上给予FPS(100 mg/kg)和丙咪嗪(20 mg/kg)处理,我们发现连续处理28天,FPS和丙咪嗪均能显著改善由慢性社会失败应激导致的行为躲避(F=3.163,P=0.036)；而更有趣的是,在连续处理14天后,FPS已能显著改善实验小鼠的行为躲避(P<0.05),而丙咪嗪此时仍未起效(P>0.05)。以上结果提示FPS具有抗抑郁作用,且起效潜伏期较传统抗抑郁药丙咪嗪快。3、FPS的作用机制：首先,单次腹腔注射FPS(100 mg/kg)或丙咪嗪(20 mg/kg),45分钟后分离大脑额前皮质,通过高效液相色谱电化学检测器(HPLC-EC)分析多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、五羟色胺(5-HT)的含量。结果发现丙咪嗪可以显著增加NE(F=2.230,P=0.018),5-HT(F=5.592,P=0.006)的含量,而对DA(F=0.394,P=0.759)无影响,而FPS对以上三种神经递质均无影响(P>0.05)。提示FPS有可能不是通过传统神经递质而起作用。其次,众多文献报道海马内BDNF的表达对抗抑郁药的起效甚为重要,因此我们通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫印迹实验(western blot)来检测FPS对海马BDNF表达的影响。结果发现单次腹腔注射FPS(100 mg/kg),6小时后能增加海马BDNF的蛋白浓度(P<0.01),提示FPS有可能通过增加海马BDNF的表达而起作用。再次,在慢性社会失败应激模型上,我们发现,当同时给予trkB (BDNF受体)的阻断剂K252a时,FPS抗抑郁以及促进神经再生的作用均被阻断,这就进一步提示了BDNF通路很有可能介导了FPS的抗抑郁以及促神经再生的作用。第三部分,PF促成年海马神经元再生及其抗抑郁作用研究。1、PF促进成年海马神经元再生的作用：首先成年C57BL/6J小鼠腹腔注射给予PF处理,间隔10分钟再给予BrdU (75 mg/kg)腹腔注射一次,24小时后经心脏穿刺进行灌注固定,取脑进行BrdU免疫组化染色,光镜下计算海马SGZ中BrdU阳性细胞数。结果发现PF 0.5 mg/kg和1 mg/kg均能显著增加SGZ中BrdU阳性细胞数(F=8.755,P=0.003),且1 mg/kg剂量组效果更明显(P<0.01),提示PF可以促进成年海马神经元的增殖；其次,连续给予PF(1 mg/kg)腹腔注射7天,每天同时进行腹腔注射BrdU(75 mg/kg),停药28天后处死动物,取脑进行BrdU/NeuN免疫荧光双标记以及DCX染色,分别在激光共聚焦显微镜、荧光显微镜下观察,记录海马SGZ中BrdU+细胞数目、NeuN+/BrdU+细胞数目和DCX+细胞数目。结果发现PF能显著增加SGZ中BrdU+细胞(P<0.001)、NeuN+/BrdU+细胞(P<0.001)以及DCX+细胞(P<0.01)的数目,这提示PF促增殖的新生细胞中大部分向神经元的方向分化。由此表明,PF具有促进成年海马神经元再生的作用。2、PF的抗抑郁作用：首先,将PF分为0.25,0.5,1.0 mg/kg共3个剂量组,同时采用临床上常用的抗抑郁药弗罗西汀(20 mg/kg)和丙咪嗪(15 mg/kg)作为阳性对照,无抗抑郁作用的其他精神类药物氟派啶醇(1 mg/kg)则作为阴性对照,单次腹腔注射30分钟后行FST和旷场实验检测,我们发现PF与弗罗西汀、丙咪嗪一样,均能显著缩短C57BL/6J小鼠不动时间(Immobility) (F=3.788,P=0.003),而氟派啶醇处理与对照组相比则无差异,同时,它们对C57BL/6J小鼠自发活动能力均无影响,提示PF具有抗抑郁作用；其次,连续腹腔注射PF(1 mg/kg)7天,停药28天后行FST和NSF检测,结果发现间隔1个月后PF仍能显著缩短C57BL/6J小鼠的不动时间(t=4.071,P=0.001),也能缩短其在新环境中的进食潜伏期(t=2.624,P=0.017),而随后的食物消耗检测表明PF处理组与对照组并无统计学差异(t=-0.322,P=0.751),进一步提示PF具有抗抑郁作用,且其抗抑郁效果能维持较长一段时间。再次,采用慢性轻度不可预知性的应激模型(CMS)复制抑郁症动物模型,每周分别测量并记录动物的毛发状况、糖水消耗以及糖水偏好等行为指标的变化情况；PF处理于CMS第4周开始,持续28天(CMS共7周,治疗处理在最后4周),同时设丙咪嗪(20 mg/kg.腹腔注射,1/日)阳性对照、生理盐水为空白对照。实验结果表明,应激处理3周后,动物明显表现出抑郁的症状,毛发评分、糖水消耗以及糖水偏好等指标均显著下降(CMS组与对照组比较,P<0.001)；PF和丙咪嗪均能够显著改善动物的抑郁症状,增加毛发的评分、糖水消耗量以及糖水偏好指标(与生理盐水处理组进行比较,P<0.001),进一步表明PF具有显著的抗抑郁疗效。此外,与丙咪嗪相比,PF还具有快速起效的抗抑郁效果。3、PF的作用机制：大量的文献报道称海马内的BDNF和VEGF对抗抑郁药的起效非常重要,为探讨这两个蛋白是否参与了PF的作用机制,本实验采用单次腹腔注射PF(1mg/kg)、弗罗西汀(20 mg/kg)、丙咪嗪(15 mg/kg)以及氟派啶醇(1 mg/kg),分别于给药后6小时、12小时处死动物,通过ELISA的方法来检测海马BDNF和VEGF的蛋白浓度变化。结果表明,PF在处理后6小时和12小时均显著增加了海马BDNF蛋白的水平(F=3.183,P=0.014),VEGF的浓度也在PF处理后6小时有显著升高,但在处理后12小时则下降到正常水平。而弗罗西汀、丙咪嗪以及氟派啶醇的处理与对照组相比无统计学差异。提示PF有可能通过增加海马BDNF和VEGF的表达而产生抗抑郁以及促神经再生的作用,同时BDNF水平的持续增高有可能是PF抗抑郁效果维持较长一段时间的一个重要机制。综上所述,促成年海马神经元再生可以作为新型抗抑郁药物的有效筛选方法；FPS和PF均能够促进成年小鼠海马的神经再生,并且能够显著改善抑郁动物的抑郁症状,FPS比传统抗抑郁药起效快,而PF除了起效快之外,还能维持更长的抗抑郁效果,BDNF通路可能介导它们在抗抑郁以及促神经再生的作用；提示FPS和PF有望作为一种新抗抑郁药应用于临床。