背景:严重创伤、感染以及骨肿瘤切除后常导致严重的骨组织缺损,特别是大段骨缺损,不仅增加治疗难度,且容易致残、后期治疗困难。修复大段骨缺损并重建其功能一直是骨科难题及研究热点。目前临床上治疗大段骨缺损多采用自体骨和异体骨。带血管自体骨移植修复大段骨缺损,手术操作复杂,患者手术负担重,况且自体骨毕竟有限。异体骨虽来源广泛,但存在免疫排斥及传播疾病的危险。随着骨组织工程快速发展,组织工程骨有可能成为修复大段骨缺损较理想的方式。组织工程骨以其来源充足、生物功能与自体骨相似或更优,在骨缺损的修复中显示出前所未有的优越性。骨组织工程的研究是将种子细胞与骨支架材料复合后置于预先设计好的生物反应器内,待其完成血管化以及成骨之后,将其移植入体内骨缺损处,进行缺损组织的再生修复。本课题分为三部分:(1)采用可溶聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)球模注浆技术制备可降解连通多孔生物陶瓷人工骨材料(即β-磷酸三钙,β-tricalcium phosphate,β-TCP),检测其性能表征;(2)采用全骨髓贴壁法从兔骨髓中提取、培养骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),并进行传代及鉴定,将其作为种子细胞;(3)以灌注型生物反应器为载体,将BMSCs接种于β-TCP形成细胞/材料复合物,通过不同灌注流速对细胞/材料复合物进行灌注培养,评估其对BMSCs增殖及成骨分化的影响。第一部分可降解连通多孔生物陶瓷人工骨材料的制备及性能表征目的:制备并检测可降解多孔β-TCP支架材料的理化性能,优化人工骨材料的制备规格,研究人工骨材料在体外的理化性能,评估其应用于骨组织工程生物材料的可行性。方法:(1)利用扫描电镜观察多孔β-TCP支架材料表面及内部形态;(2)利用扫描电镜测量材料实际孔径、孔内连通径数值;(3)利用X射线能谱仪对多孔β-TCP支架材料表面、横断面、纵切面元素进行分析;(4)利用接触角测量仪对多个多孔β-TCP支架材料表面、横切面、纵切面的接触角进行检测;(5)利用电子万能材料力学试验机对多孔β-TCP支架材料进行抗压强度测定;(6)利用重量体积法及Archimedes排水法计算多孔β-TCP支架材料的孔隙率等,并计算吸水率。结果:多孔β-TCP支架材料孔径均匀,孔径大小波动在500μm左右,各孔隙相互连通,连通径大小120μm左右,孔隙率大于60%,支架表面微结构粗糙呈颗粒状,凹凸不平,属于弱疏水性材料,各支架间吸水性较均一,Ca/P比=1/0.67与天然骨接近,生物力学结果显示多孔β-TCP支架材料与天然松质骨类似。结论:采用可溶聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)球模注浆技术制备可降解连通多孔生物陶瓷人工骨材料性能表征良好,多项指标接近天然骨,完全符合骨组织工程材料对孔径、孔隙率及力学性能的要求,可作为构建组织工程骨研究理想生物材料。第二部分骨髓间充质干细胞的提取、培养、传代及鉴定目的:将BMSCs作为骨组织工程的种子细胞,对其进行提取、培养、传代及鉴定,以评估其纯度及鉴定其向成骨和成脂肪分化的能力。方法:采用全骨髓贴壁法将从新西兰白兔股骨及胫骨骨髓腔提取的骨髓进行分离并提纯BMSCs。观察BMSCs形态及生长方式,用成骨成及脂肪诱导试剂盒对其分别进行成骨及成脂肪定向诱导分化,用茜素红及油红对其染色并检测BMSCs多向分化的能力,并通过流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD90的表达情况。结果:全骨髓贴壁法进行BMSCs提取及培养过程方便快捷。显微镜下BMSCs为长梭形,贴壁牢,呈旋涡状、鱼群状或放射状生长。成骨诱导3周后茜素红染色可见钙化结节,成脂诱导2周后油红染色可见胞质内充满类圆形脂滴。BMSCs表面标志物结果:CD29+、CD44+、CD90+、CD34-、CD45-。结论:全骨髓贴壁法提取、分离、培养的BMSCs增殖优良、形态好,且具有成骨、成脂肪等多向分化能力,为骨组织工程理想的种子细胞。第三部分灌注型生物反应器的设计与构建及灌注型生物反应器中流速对β-TCP内间充质干细胞增殖及成骨分化的影响目的:设计及构建灌注型生物反应器,评估其灌注流速的稳定性及可靠性;利用灌注型生物反应器不同流速对细胞/材料复合物进行培养,观察不同灌注流速下β-TCP内BMSCs的形态、增殖及成骨分化的情况,同时对不同灌注流速进行评价,从而筛选最佳灌注流速,为体内生物反应器的设计及组织工程骨的培养提供理论参数。方法:(1)接种后灌注培养1、4、7天后利用细胞增殖及毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测不同组间细胞增殖及生物相容性;(2)接种后灌注培养7天利用电子扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)观察不同组间细胞形态;(3)接种后灌注培养7天利用台盼蓝染色法计算不同组间人工骨材料上细胞的存活率;(4)接种后灌注培养7天利用碱性磷酸酶试剂盒测定不同组间人工骨材料上细胞的碱性磷酸酶活力;(5)接种后灌注培养7d、10d后利用实时定量RT-PCR检测不同组间诱导成骨效应;(6)接种后灌注培养7d通过Western blot检测技术检测不同组间成骨相关蛋白表达量。结果:各组CCK-8结果显示在培养第4d和7d时,0.01ml/min灌注流速组细胞增殖快于其他组(P<0.05),细胞出现增殖趋势说明细胞与材料生物相容性较好。扫描电镜观察发现静态培养组(0ml/min)细胞分布稀疏,呈疏松的簇状生长;0.01ml/min灌注流速组呈膜片状聚集生长,并且多数细胞伸出伪足分布在连通孔周围;0.05ml/min灌注流速组部分呈膜片状生长;0.1ml/min多数呈膜片状生长。细胞存活率检测0.01ml/min灌注流速组存活率最高。0.01ml/min灌注流速组成骨相关基因(Runx2、ALP、OPN、Col-I)及成骨相关蛋白(Runx2、OPN、Col-I)的表达水平都明显高于其它组(P<0.05),同样观察到0.01ml/min灌注流速组碱性磷酸酶活性最高。结论:β-TCP材料可诱导BMSCs向成骨分化,随生物反应器灌注流速的降低,可促进细胞外基质的合成和分布,并可增加成骨相关基因及相关蛋白的表达。其中0.01ml/min低灌注流速最有利于BMSCs的增殖及向成骨分化。