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DNA疫苗是继传统疫苗和基因工程蛋白亚单位疫苗之后的新一代疫苗,质粒DNA大规模制备技术对DNA疫苗的产业化具有重要意义。论文第一部分从我国重大科研课题的需求以及生物制药行业发展的前景出发确立了HIV-1 DNA疫苗中试生产工艺研究课题。在上下游研究、生产和质控人员的配合下,经过不懈努力,比较顺利的完成了课题任务。基于实验室小试工艺研究的基础之上,在GMP条件下,成功地实现了DNA疫苗生产工艺的放大,建立了有自主知识产权的临床用DNA疫苗制备工艺。稳定了75 L发酵罐补料分批发酵工艺,发酵20小时后收获菌体约60g湿菌体/ L,质粒产量≥60mg/L。在确保高密度培养的前提下实现了质粒的高产量。通过组合多种质粒DNA纯化手段并优化各种参数,建立了稳定、简单、易放大的DNA疫苗中试纯化工艺。运用LiCl沉淀和精胺沉淀等粗纯手段把绝大多数杂质成分消灭在大容量、低成本的粗纯阶段。在做好粗纯的基础上尽可能减少昂贵费时的层析工艺步骤,简化整个流程。DNA疫苗纯化工艺开发较好地贯彻了“强化提取、简化精制”的指导原则,生产出了符合临床应用要求的DNA疫苗制品,总体质粒收率大于40%。与国外工艺相比,该工艺减少了精制工艺步骤、缩短了纯化周期,降低了生产成本。另外,我们还建立了一套完整的产品质量控制体系,以确保生产工艺和产品质量的稳定性。HIV-1 DNA疫苗成品经中国药品生物制品检定所检定,所有检定指标均符合临床用DNA疫苗质量标准,将用于我国艾滋病疫苗的临床试验。现有的蛋白亚单位疫苗的一个主要缺点是不能有效地诱导抗原特异性细胞免疫反应,本课题第二部分的研究思路是利用蛋白质转导结构域(protein transduction domain , PTD)把目的蛋白导入细胞以探讨增强细胞免疫的可能性。利用HIV的TAT蛋白所携带的蛋白质转导结构域编码序列,使用PCR方法在HIV-1 CN54 p24基因的5’端融合了TAT基因序列,构建PTD-P24融合基因。使用Nde I和EcoR I双酶切,插入pThioHisA表达载体,构建了pThioHisA- PTD-P24质粒。实际上同时构建了一个含有pThioHisA-PTD载体,使用BamH I和EcoR I双酶切后可以很方便的插入另一个基因,进行其他研究。优化表达条件在摇瓶中实现了非融合蛋白PTD-P24在大肠杆菌中的可溶性高效表达,SDS-PAGE显示PTD-P24蛋白表达量达到菌体总蛋白达的45%。Western-blot实验表明目的蛋白具有良好的抗原性。采用弱阳离子交换层析纯化PTD-P24蛋白,纯度达到95%以上,此纯化策略易放大,步骤简便,收率高。PTD-P24蛋白的构建、表达和纯化工作为进一步的临床前研究和中试生产奠定了坚实的基础。