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目的:从基因水平、蛋白水平及细胞壁多糖水平对肺炎链球菌(SP)准确鉴定方法学进行探究;分析我国多中心侵袭性SP的血清学分型和分子流行病学分型;对我国侵袭性SP药物敏感性及青霉素结合蛋白(PBP)进行突变分析;研究我国侵袭性SP主要流行血清型毒力差异。方法:本研究纳入北京协和医院181株草绿色链球菌(VGS)及2010-2015年全国27家中心分离的300株侵袭性SP。以16S rRNA和gyrB基因测序为金标准,比较两台质谱仪对181株VGS的鉴定性能。通过流式细胞仪和高分辨率荧光显微镜分析双花扁豆凝集素(Dolichos biflorus agglutinin,DBA)和蜗牛凝集素(Helix pomatia agglutinin,HPA)与不同血清型SP细胞壁的结合情况,通过Janus Cassette和pPEP1表达质粒构建基因敲除及回补株,探究磷酰胆碱酯酶(Pce)对结合的影响。通过荚膜肿胀试验和多位点序列分型(MLST)对300株侵袭性SP进行血清型分型和分子分型,比较多重PCR和cpsB基因测序的方法进行血清分型的准确性。以标准微量肉汤稀释法检测20种抗菌药物的体外敏感性;对pbpla、pbp2b和pbp2x进行扩增测序并分析其位点突变情况,研究青霉素耐药表型与基因型的关系。通过小鼠腹腔感染菌血症模型对我国主要流行血清型进行毒力差异研究,通过荧光定量PCR的方法比较血清群6内不同菌株非荚膜相关毒力基因ply、lytA、nanA、psaA、pspA及HylA的mRNA表达水平。结果:布鲁克质谱对VGS缓症群区分度较差,易将缓症链球菌、口腔链球菌及假肺炎链球菌鉴定为SP。梅里埃质谱IVD系统对SP的鉴定敏感性和特异性高,但由于菌种库限制,缓症链球菌/口腔链球菌以复合体结果展示。基于此结果建立了质谱联合16S rRNA和gyrB基因测序的实验室VGS鉴定流程。DBA/HPA与SP细胞壁磷壁酸结合,依赖于菌株体内Pce活性,首次发现pce allele B,仅见于血清型11A和11E的菌株。我国SP引起的IPD患者中,以儿童居多,尤以5岁以下儿童居多,约占所有侵袭性感染SP疾病的50%,以血流感染为主。共检测出40种血清型,1株不可分型(NT)株,常见血清型依次为23F、19A、19F、3、14、6A 和 6B,PCV7、PCV10、PCV13 及 PPV23 的覆盖率分别为 42.3%、45.3%、73.3%和79.3%。从检测准确性及操作简便性考虑,cpsB基因测序分型优于多重PCR血清分型方法,适合大多数实验室采用。MLST共检测出123种序列型(ST),其中33个为首次发现,以ST320、ST81、ST271、ST876最为常见,几个主要的克隆复合群与血清型具有明显的对应关系,CC320→19A、CC271→19F、CC81/CC880→23F、CC876→14、CC3173→6A、CC505→3。我国分离的侵袭性SP对厄他培南、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺及万古霉素全部敏感,而对阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、克林霉素、氯霉素和四环素耐药率均超过90%。除亚胺培南外,侵袭性SP对其他抗菌药物2010年至2015年耐药率均有所下降。血清型23F、19A和19F是主要的耐药血清型,血清型3敏感性较高;ST271、ST320及ST81是主要的耐药序列型,ST180和ST505对大部分抗菌药物的敏感性较高。疫苗覆盖血清型菌株对大部分抗菌药物耐药率均高于非疫苗覆盖血清型菌株。2010-2015年间疫苗非覆盖血清型菌株对部分抗菌药物年度耐药率呈上升趋势。脑脊液分离的侵袭性SP对青霉素耐药率较高,而非脑脊液(主要为血液来源)分离的侵袭性SP无耐药株。菌株PBP蛋白突变呈高度多样化,主要与青霉素MIC有关,与样本来源、判定折点无关。青霉素MIC值≤0.25μg/ml的菌株均无PBP活性位点突变,1株血清型6A(MIC=0.25 μg/ml)除外(PBP2b活性中心发生T451A突变)。青霉素MIC值≥0.5 μg/ml的菌株均存在不同程度的PBP活性位点突变。青霉素高MIC水平(MIC≥1 μg/ml)的菌株均存在PBP1a活性位点突变,并同时伴有PBP2b和PBP2x突变。非脑脊液来源的侵袭性SP即使表型判定为敏感,仍存在不同PBP活性位点的突变,临床使用需注意。PBP1a分析序列中共检测出105个不同的点突变,PBP2b分析序列中共检测出111个不同的点突变及2个插入突变,2个插入突变YIW和YTW分别位于2株血液来源PSSP中,均为国际首次报道。PBP2x分析序列中共检测出98个不同的点突变。小鼠体内试验显示,血清型3为强毒力血清型,血清型23F、19A、19F和14表现为无毒力,血清群6内不同血清型、不同菌株间毒力水平有所差异。血清群6内菌株各毒力因子的表达水平与动物实验毒力水平间无明显对应关系。结论:梅里埃质谱IVD系统对SP的鉴定性能优于布鲁克质谱,可用于SP的准确鉴定。DBA/HPA可以与不同血清型肺炎链球菌结合,磷酰胆碱酯酶基因pce是DBA/HPA与SP结合的决定性因素,pce allele B仅在血清型11A和11E菌株中发现,或可用于血清型预测。我国侵袭性SP以血清型23F、19A、19F、3、14、6A和6B为主,以ST320、ST81、ST271、ST876最为常见。尽管我国疫苗接种率较低,非疫苗覆盖血清型分离率呈上升趋势,出现血清型转换,可能为抗菌药物选择性压力结果。PBP1a活性位点突变是引起菌株青霉素高MIC水平(MIC≥1μg/ml)的必要条件,但需同时伴有PBP2b和/或PBP2x突变。我国流行血清型3菌株呈高毒力、低耐药特点。血清型23F、19A、19F、14呈低毒力、高耐药特点,而血清型6A、6B及6C的菌株间毒力水平不一。本研究为提高常规实验室SP准确鉴定能力、了解我国侵袭性感染SP血清学、分子型别、耐药性及主要流行血清型毒力情况提供了重要的参考依据,也为我国疫苗的使用或研发提供流行病学基础。