论文部分内容阅读
荧光成像和分析方法具备灵敏度高、选择性好、方便快速等优点,已经作为一种重要的研究手段,在生化分析中得到广泛应用。荧光探针是荧光成像和分析方法的核心和基础。传统荧光探针大多基于有机小分子染料作为信号分子,存在荧光稳定性差、荧光寿命短等缺陷,限制了其应用范围。近年来,随着纳米技术的发展而兴起的基于新型荧光纳米材料的荧光探针不仅克服了传统有机染料的缺陷,还具有尺寸可控、荧光光谱可调、比表面积大等优异的理化性质。其中,DNA稳定的银纳米簇在具备优良荧光特性的同时,还拥有生物相容性好、水溶性佳、合成简单、成本低廉且易于功能化改性等优势,从而在生化分析领域受到了重要关注。然而,目前有关DNA-银纳米簇荧光探针的研究依然存在一定问题:一方面,亚细胞和细胞层面的研究工作涉猎很少,尤其是DNA-银纳米簇激活式荧光探针亟待开发;另一方面,现有DNA-银纳米簇在荧光量子产率和稳定性方面的性能尚无法满足复杂生物样品和痕量物质分析需求。基于此,本论文即瞄准这两个方面,分别选择细胞核成像和miRNA检测这两大研究体系,开发了两种新型DNA-银纳米簇激活式荧光探针,发展了简单方便的新型特异性成像和检测技术,具体包括以下工作:一、基于细胞核原位增强效应的DNA-银纳米簇激活式荧光探针用于细胞成像研究本文选择碱基序列为5’-CCCTTAATCCC-3’的DNA为模板合成了具有富G序列邻近荧光增强效应的DNA-银纳米簇,并利用真核细胞核内端粒序列富含鸟嘌呤的特点,构建了 一种具有细胞核原位荧光激活效应的新型DNA-银纳米簇激活式探针,用于细胞核特异性成像。研究表明,该探针在缓冲液体系中可被端粒序列有效激活,荧光增强倍数高达12.7。选取固定化CEM细胞为研究模型,采用流式细胞术考察发现,该探针在细胞内具有明显的荧光增强效果,且激活效率受到探针工作浓度、作用时间以及合成模板序列组成等多种因素的影响。激光共聚焦成像考察证实,银簇发光位置集中于细胞核内,且发光机制确实是由于银簇荧光在细胞核中被原位激活。随后,选择未经固定化处理的C E M活细胞以及H e 1 a、SMMC-7721和HBL-100等三种细胞系研究发现,该银簇对细胞核的荧光标记性能具有很好的通用性,且作为特异性核染探针能够实现对核酸适配体AS1411靶向识别功能的有效表征。该基于细胞核原位增强效应的DNA-银纳米簇激活式荧光探针有望发展成为一种简单方便、免洗涤且免标记的通用平台用于细胞核特异性成像研究。二、基于竞争杂交响应的DNA-银纳米簇激活式荧光探针用于miRNA检测研究本文选择碱基序列为5’-TACCCCACCCACCCTCCGGGTTTT-3’的DNA为模板合成了一种具有荧光强度超高、抗光漂白能力强等优越光学性能的DNA-银纳米簇,并在此基础上引入淬灭基团BHQ-1标记的封闭探针,结合荧光共振能量转移机制,构建了一种具有竞争杂交响应性能的新型DNA-银纳米簇激活式荧光探针,用于miRNA检测。当靶核酸分子不存在时,带有银纳米簇尾巴的DNA探针与封闭探针互补杂交形成双链,此时银纳米簇荧光被BHQ-1淬灭;而当靶标存在时,通过竞争杂交将封闭探针挤下来,导致BHQ-1远离银纳米簇,荧光得以恢复。以miRNA-21为模式靶标,通过优化封闭探针序列、银纳米簇浓度及其与封闭探针的比例等工作条件,成功实现了对miRNA-21的选择性定量分析,线性范围为100 pM-20 nM,检测下限为100 pM。该基于竞争杂交响应的DNA-银纳米簇激活式荧光探针有望发展成为一种简便、低耗、免洗、灵敏且特异的通用型平台用于核酸分析研究。