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目的通过加权基因共表达网络(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)方法研究肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中肝癌干细胞(Liver cancer stem cells,LSCS)相关基因的表达及其与预后的相关性。方法(1)从公共数据库癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中下载HCC转录组测序(RNA-seq)数据及临床病理学资料,从CELL网站下载并整理肿瘤干细胞干性指数(mRNA stemness indices,mRNAsi)表,分析mRNAsi与HCC临床病理因素及预后的关系。(2)利用加权基因共表达网络从肝癌差异基因中筛选与LSCS相关的关键模块,截取关键模块的hub基因进行功能注释(GO分析)及信号通路富集分析(KEGG分析),通过在线数据库STRING构建hub基因编码蛋白质相互作用网络(protein protein interaction network,PPI),从PPI中筛选关键基因。(3)对关键基因进行表达差异分析及表达相关性分析。(4)通过在线数据库人类蛋白质图谱(The Human Protein Atlas,HPA)查找并统计关键基因编码蛋白在HCC肿瘤组织及肝脏正常组织中免疫组化染色结果,验证关键基因表达差异。(5)利用在线数据库生存曲线绘制仪(Kaplan-Meier plotter)进行生存分析,利用肝细胞癌综合分子数据库(HCCBD)中数据集验证生存分析结果。(6)收集44例HCC组织样本进行免疫组织化学染色,进一步验证关键基因CCNB1在HCC和癌旁组织中的表达差异及其表达与临床病理因素相关性。结果(1)HCC组织中的mRNAsi得分显著高于正常肝组织(P<0.001),mRNAsi与高病理学等级之间存在正相关(P=0.006),高mRNAsi组的HCC患者死亡率高于低mRNAsi组(P=0.006)。(2)WGCNA网络筛选蓝色模块为LCSC相关模块,从中截取24个hub基因,通过GO分析结果显示,hub基因主要参与有丝分裂姐妹染色单体分离、核染色体分离、核分裂、DNA构象变化等生物过程。KEGG分析结果显示,hub基因富集在细胞周期、错配修复、卵母细胞减数分裂、DNA复制等信号通路,PPI结果表明hub基因编码蛋白质之间有很强的相互作用(P<0.001)。(3)本研究筛选了10个与LSCS相关的关键基因(包括CCNB1、CDC20、CDCA8、NDC80、KIF20A、CDC45、KIF15、MCM2、TTK及NCAPG),与正常肝组织样本相比,10个关键基因在HCC组织中均呈现高表达(P<0.001),在转录水平上也有很强的共表达关系(相关系数均>0.70)。(4)人类蛋白质图谱鉴定关键基因均为癌症相关基因且在HCC组织中高表达(缺NCD80数据)。(5)k-m plotter数据库生存分析及HCCDB数据集验证结果均表明10个关键基因均与肝癌患者的预后相关,高表达组预后总生存时间(Overall Survival,OS)显著低于低表达组(P<0.05)。(6)免疫组化结果证实CCNB1在HCC中高表达且与肿瘤大小、肿瘤数目、有无肝硬化、Ki67表达量密切相关(P<0.05),与其他病理学指标(AFP、分化程度、TNM分期、有无门静脉癌栓等)无明显相关性(P>0.05)。结论(1)mRNAsi在HCC的发生发展中起着重要作用,利用WGCNA筛选的与HCC-mRNAsi相关的10个关键基因(CCNB1、CDC20、CDCA8、NDC80、KIF20A、CDC45、KIF15、MCM2、TTK及NCAPG)在LSCS的干性维持中发挥重要作用,有望作为抑制HCC干细胞特性的治疗靶标及预后标志物。(2)CCNB1在HCC组织中高表达,并且与HCC的肿瘤大小、肿瘤数量、有无肝硬化及Ki67表达百分比有关,提示CCNB1可能在肝细胞癌的进展和转移过程中发挥重要作用,CCNB1可能成为HCC的重要分子标记物及肝细胞癌治疗的潜在靶点。