心血管疾病发病率逐年增高，目前是威胁人类生命的主要疾患之一。血管移植手术是临床治疗心血管疾病的常用手段。目前最理想的血管代用品仍是自体血管，但是因常难以获取合适的血管，临床应用受到限制，而临床常用的Dacron和ePTFE人工血管虽然在高流速低阻力情况下（如大口径周围动脉）应用效果满意，但是在应用于小口径血管（＜6mm）移植时，往往会因血栓形成，内膜过度增生及感染等因素导致远期通畅率差，临床应用结果很难令人满意。近些年来，血管组织工程学的研究为解决上述难题提供了新的途径。组织工程血管构建主要包括三方面内容，即种子细胞，血管支架构建，体外培养构建环境。近年来，内皮祖细胞因具有强大的增殖潜能，具有稳定的表型和功能，可分化为内皮细胞，作为理想的种子细胞已广泛应用于组织工程血管构建;以天然生物材料和人工合成生物构建复合血管支架因可提高支架材料的生物力学性能及生物相容性也已成为研究热点，而电纺丝技术能方便地构建模拟细胞外基质形态结构的纳米纤维支架在血管支架构建方面应用也越来越广;体外培养环境可促进细胞粘附增殖生长促进组织工程血管重塑成熟，以模拟体内生理环境为目的的生物反应器的研究对于体外构建组织工程血管意义重大。本研究经外周血分离获取内皮祖细胞作为构建组织工程血管的种子细胞，利用电纺丝技术制备复合聚己内酯/壳聚糖纳米纤维血管支架，在体外将内皮祖细胞和聚己内酯/壳聚糖纳米纤维血管支架复合进行动态培养构建组织工程血管再移植到兔体内进行动物实验评估及各项性能，尝试构建一种全新的组织工程血管。全文分为四个部分:　　第一部分外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定　　目的:建立经外周血分离内皮祖细胞(EPCs)并进行体外培养和鉴定的方法，选择合适的 EPCs作为种子细胞用于体外构建组织工程血管。　　方法:经外周静脉或经兔心穿刺获取外周血，应用密度梯度离心法获取外周血单核细胞，在体外进行诱导培养获取人和兔内皮祖细胞。在体外培养过程中，可获取早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞，我们对其生长形态、增殖潜能、细胞表型、蛋白表达、血管形成能力、生长因子分泌情况及一氧化氮释放情况进行了鉴定，比较了两类细胞的不同特性，以选择合适的内皮祖细胞用于组织工程血管构建。　　结果:早期和晚期内皮祖细胞均来源于单核细胞，但它们具有不同的特性:人早期内皮祖细胞为纺锤状细胞，在培养的4-7天出现，生长寿命短，增殖能力弱，而晚期内皮祖细胞呈卵圆形外观，在培养的2-3周内出现，具有强大的增殖能力;在细胞表型方面早期内皮祖细胞表现为造血干细胞-单核细胞表型，而晚期内皮祖细胞更类似于内皮细胞表型;晚期内皮祖细胞可在Matrigel上形成毛细血管网状结构而早期内皮祖细胞则不能，虽然早期内皮祖细胞可分泌更多的血管源性生长因子（IL-8、VEGF及G-CSF）。此外，两类内皮祖细胞均表达内皮一氧化氮合酶，且可以释放一氧化氮。对于兔外周血内皮祖细胞的研究也有类似结果。　　结论:1.密度梯度离心法分离分离外周血单核细胞进行体外诱导培养可获取两类内皮祖细胞即早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞;2.外周血晚期内皮祖细胞具有强大增殖能力，稳定细胞表型和类似内皮细胞的功能特性，并可分化为内皮细胞可作为理想的种子细胞来源用于组织工程血管构建。　　第二部分聚己内酯/壳聚糖纳米纤维组织工程血管支架的制备和其性能研究　　目的:应用电纺丝技术制备聚己内酯/壳聚糖纳米纤维组织工程血管支架，为构建组织工程血管提供理想的支架材料。　　方法:将聚己内酯和壳聚糖共同混溶于90％浓醋酸，搅拌混合均匀获取电纺丝溶液，应用电纺丝技术构建膜状、管状聚己内酯/壳聚糖纳米纤维组织工程血管支架，同时构建单纯聚己内酯和壳聚糖纳米纤维支架用于对比。通过倒置显微镜及扫描电镜研究支架结构及形态，并对其生物力学性能、亲水性进行研究比较。为研究组织工程血管支架生物相容性，将晚期内皮祖细胞种植于支架表面，研究了细胞粘附、生长增殖及在材料表面分布情况。　　结果:应用电纺丝技术可成功构建新型的复合聚己内酯/壳聚糖纳米纤维支架，其纳米纤维直径平均约550nm，呈无序排列，有较大孔隙率。与其他两种支架材料相比，聚己内酯/壳聚糖具有优秀的生物力学性能，其抗张强度为(2.7±0.4 MPa)，最大拉伸率为(0.65±0.07)，缝合撕裂强度为（2.5±0.4 N）;通过MTT分析、扫描显微镜及荧光显微镜观察及一氧化氮释放分析结果表明聚己内酯/壳聚糖支架与晚期内皮祖细胞有良好的生物相容性。　　结论:复合聚己内酯/壳聚糖纳米纤维支架具有出色的生物力学性能和良好的生物相容性。这些结果表明此种全新的复合组织工程支架可用于构建组织工程血管，其在血管组织工程方面有良好应用前景。　　第三部分晚期内皮祖细胞复合聚己内酯/壳聚糖纳米纤维支架体外构建组织工程血管的实验研究　　目的:探讨应用晚期内皮祖细胞复合聚己内酯/壳聚糖纳米纤维支架体外动态培养构建组织工程血管的可行性。　　方法:应用前一部分方法构建组织工程血管管状支架备用。将培养的3代的兔晚期内皮祖细胞用0.125％胰酶消化，收集细胞，CM-DiI标记后制成细胞悬液，将细胞悬液分次注入管状支架管腔，并注意旋转支架位置使细胞均匀分布。之后将支架转到自制的动态反应器中培养，隔天更换培养液。动态培养7天后，取复合动态培养的组织工程血管组织进行光镜、电镜观察晚期内皮祖细胞在聚己内酯/壳聚糖纳米纤维管状支架上架上的黏附、生长及分布情况;激光共聚焦显微镜下观察血管组织切片能否见到CM-DiI染色阳性（发红色荧光）细胞黏附及生长。应用FITC-鬼笔环肽荧光染色检测动态培养流体应力对细胞分布及细胞骨架蛋白分别等影响。同时利用生物力学测定仪检测动态培养后组织工程血管的力学性能。　　结果:体外动态培养后，晚期内皮祖细胞复合组织工程血管支架构建的组织工程血管具有合适的生物力学性能。组织学分析表明组织工程血管结构更加紧密，管腔内壁可见细胞粘附，形成内皮单层。荧光染色分析及扫描电镜观察证实晚期内皮祖细胞与支架材料结合紧密，生长良好，可在管腔内壁初步实现内皮化，并发现细胞沿流体方向排布，且F-actin也沿流体方向进行重塑。　　结论:1.体外动态培养构建组织工程血管，可促进细胞粘附生长实现初步内皮化，可促进组织工程血管重塑成熟;2.兔外周血晚期内皮祖细胞复合聚己内酯/壳聚糖纳米纤维支架可于体外成功构建组织工程血管，有望进一步用于组织工程血管研究。　　第四部分组织工程血管动物体内移植实验研究　　目的:建立兔腹主动脉-髂动脉血管转流动物模型，观察经体外构建的组织工程血管在移植后短期的组织形态学变化、内皮细胞覆盖情况及通畅率情况。　　方法:体外将CM-DiI标记的兔晚期内皮祖细胞与聚己内酯/壳聚糖纳米纤维支架复合体外构建组织工程血管。以新西兰大白兔为研究对象，构建兔肾下腹主动脉-髂动脉转流动物模型。移植后每周彩色多普勒超声随访检查，观察组织工程血管动物体内通畅率及管腔结构变化。移植后6周，行CTA检查证实通畅情况及组织工程血管有无形态变化。取出移植段动脉标本，进行大体观察，HE染色，光镜及SEM观察组织工程血管结构变化及管腔内皮化情况。CM-DiI和FITC-vWF荧光双染色被用于检测血管管腔内壁内皮化情况及内皮细胞来源。此外对移植后组织工程血管的生物力学性能变化情况也进行了检测。　　结果:移植后1周两例组织工程血管闭塞经证实为血栓形成，余下在6周动态过程过程中均保持通畅且形态结构物明显退行性变。短期内通畅率为86.7％(10/12)。6周后取出组织工程血管，见通畅的组织工程血管结构完整，内壁光滑无狭窄及血栓形成。HE染色显示组织工程血管与周围组织相融合，结构完整，内壁有内皮细胞覆盖;扫描电镜也进一步证实组织工程血管管腔内壁已完成内皮化过程。经荧光染色分析，管腔内壁覆盖细胞存在CM-DiI和FITC-vWF荧光双染色细胞，表明种植的晚期内皮祖细胞可分化为内皮细胞参与内皮化过程。此外生物力学性能检测发现组织工程血管机械性能稍有降低，可能与移植后体内重塑过程有关。　　结论:本研究构建组织工程血管动物体内移植后，短期内通畅率较高，具有良好的生物相容性和合适的生物力学性能。此研究为此种血管替代物的基础研究和进一步的临床应用提供了有价值的实验资料，但其长期结果等方面仍需进一步探索。