论文部分内容阅读
随着我国日益强盛,乳产业持续高速发展,国民对牛奶的需求也逐步攀升。如何进一步提升奶牛的泌乳性能和牛奶的品质以满足国民消费需求成为众多研究者关注的热点问题。奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）是奶牛乳腺中唯一具有产生和分泌乳汁功能的细胞。奶牛的产乳性能主要依靠BMECs增殖和合成乳汁的能力。乳蛋白和乳脂是牛奶中的主要营养成分,也被认为是评价奶牛产奶性能和牛奶质量的重要指标。BMECs中乳蛋白和乳脂的合成受环境、激素和生长因子等诸多因素的影响。脂肪酸（Fatty acids,FAs）是多种脂类合成的底物,也从信号传导、转录及翻译等多个层面参与调节机体内多种生物合成过程。硬脂酸（Stearic acid,SA）是一种含有18个碳的饱和长链脂肪酸,其作为瘤胃惰性脂肪酸,在调控奶牛泌乳方面具有巨大的潜力,并被作为饲料添加剂应用于奶牛养殖业。目前关于SA调控奶牛泌乳的研究主要集中在临床应用。然而,相关研究的结果不尽一致,且SA调控泌乳的具体机制也不清晰。因此,阐明SA对奶牛乳脂乳蛋白合成的影响,并揭示其潜在调控机制对奶牛养殖业合理应用SA调控奶牛泌乳、保障牛奶产业持续健康发展、提高我国牛奶产业在国际市场中的核心竞争力具有重要意义。为了阐明SA对奶牛乳脂乳蛋白合成的影响及潜在机制,本研究首先运用组织块接种法分离泌乳期荷斯坦奶牛的原代BMECs;通过差时消化法对分离的细胞进行纯化;并对上皮细胞标志蛋白角蛋白18（cytokeratin 18,CK-18）进行免疫荧光染色,鉴定本研究所获得细胞确为BMECs。使用不同浓度的SA（0、12.5、25、50、100、200μM）处理BMECs,结果发现该浓度范围内的SA对BMECs的活力没有显著影响,却显著提高了BMECs中β-casein和甘油三酯（triglycerides,TGs）的表达水平,在浓度为100μM时效果最为显著。调控机制的研究发现,SA显著激活BMECs中PI3K、m TOR和SREBP-1等信号分子的活性。为了明确这些信号分子在SA调控乳脂乳蛋白合成中的作用,m TOR的抑制剂——雷帕霉素（rapamycin,RAPA,200 n M）和PI3K的抑制剂——LY294002（15μM）分别被用来抑制m TOR和PI3K信号分子的活性。结果发现m TOR被抑制后,4EBP1、S6K和SREBP-1的活性显著降低,SA对BMECs乳脂乳蛋白合成的促进作用被阻断。抑制PI3K的活性后,SA对m TOR-4EBP1/S6K和m TOR-SREBP-1信号轴的激活作用显著减弱,这表明PI3K在SA刺激BMECs激活m TOR、SREBP-1的信号传导中具有关键作用。之前的研究发现细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinases 1,CDK1）通过影响翻译因子的活性参与调控蛋白质合成。在本研究中SA显著上调了BMECs中CDK1的蛋白水平。因此,本研究构建了CDK1-si RNA和CDK1-pc DNA,探索其在SA调控BMECs乳脂乳蛋白合成中的作用。结果显示CDK1缺失后阻断了SA对BMECs中上述信号通路的激活及促进乳脂乳蛋白合成的作用;而过表达CDK1后,即便没有SA的刺激,PI3K-m TOR-4EBP1/S6K和m TOR-SREBP-1信号轴也被显著激活。这些结果均提示CDK1先于上述信号分子响应SA的刺激,对BMECs的乳脂乳蛋白合成具有积极作用。此外,SA属于长链脂肪酸（long chain fatty acids,LCFAs）,需要转运蛋白的协助进入细胞。因此,本研究检测了在SA的刺激下,BMECs中脂肪酸转运蛋白（Fatty acid transport proteins,FATPs）的表达变化。结果发现,当使用100μM的SA刺激BMECs时,FATPs中FATP3和FATP4的m RNA水平被显著上调,并发现FATP4的m RNA基础表达丰度最高。以往的众多研究表明FATP3主要负责调控长链脂酰辅酶A合成酶的功能,转运LCFAs的能力较弱,而FATP4转运LCFAs的能力远高于FATP3,是主要的LCFAs转运蛋白。因此,本研究重点关注了FATP4,通过构建FATP4-si RNA,检测其对SA调控BMECs中乳脂乳蛋白合成的影响。结果显示FATP4缺失后,SA上调BMECs中CDK1的蛋白水平和PI3K-m TOR-4EBP1/S6K和m TORSREBP-1信号轴活性的作用被阻断,对乳脂乳蛋白合成的促进作用消失。这表明FATP4是介导SA跨膜转运进入BMECs的主要转运子。综上所述,本研究发现SA促进BMECs中乳脂乳蛋白的表达,明确了SA对奶牛泌乳具有积极影响;揭示了SA被FATP4转运入BMECs,上调CDK1的蛋白水平,继而激活PI3K-m TOR-4EBP1/S6K和m TOR-SREBP-1信号轴,最终促进BMECs中β-casein和TGs的合成。本研究的发现为奶牛养殖业合理使用SA调控奶牛泌乳提供了理论支撑,对我国牛奶产业合理健康发展具有重要意义。