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基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)是包被囊膜的单股正链RNA病毒,是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)中的一员,蚊虫叮咬是其主要传播途径,人被感染后会引起发热、头痛、斑丘疹及全身性关节炎等症状,极少数患者可能会出现脑膜炎、心肌炎、肝功能损伤及皮肤黏膜出血,给人类生命健康带来极大威胁。随着全球气候变暖,各国交流日加频繁,此病毒的传播范围也在随之扩大。2008年,我国发现首例CHIKV的输入性病例,之后每年都有输入性病例报道。我国分布有可传染CHIKV的蚊虫种类,因此存在大范围爆发的可能性。然而,目前对此病毒的研究并不透彻,尚无有效的预防和治疗手段,所以前期对于病毒的检测诊断显得尤为重要。本文针对CHIKV检测诊断方法的建立做了以下两部分工作:(1)CHIKV和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)双重荧光定量RT-PCR方法的建立;(2)针对CHIKV结构蛋白E2单克隆抗体的制备与鉴定。(1)CHIKV和ZIKV双重荧光定量RT-PCR方法的建立由于CHIKV和ZIKV在发病初期的症状十分相似(发热,头痛,全身肌肉痛等),很难单靠临床症状确诊病毒感染类型,需要依靠灵敏度高的核酸诊断检测技术进行检测。而荧光定量PCR方法(Real-time PCR)就是其中一种快速且灵敏度很高的核酸检测技术。为了同时检测并能区分上述两种病毒,我们建立了一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法(one-step multiplex real-time RT-PCR assay)。该方法可有效检测病人体内CHIKV和/或ZIKV的病毒RNA含量,具有高灵敏度和高特异性等特点,为后期及时采取相应治疗措施提供有效诊断依据。首先我们分别设计合成了针对CHIKV nsP1和ZIKV NS5的最佳引物和TaqMan探针,按照荧光定量RT-PCR体系配制了能同时检测两种病毒的反应体系,通过对该体系建立标准曲线检测其扩增效率和相关性,并对其特异性和灵敏度等进行了检测,最后应用于临床样本检测。结果表明我们所建立的检测体系对CHIKV和ZIKV的扩增效率分别是:97.99%,99.98%;相关性分别是:R~2=0.9977,R~2=0.9994;灵敏度分别是:1 PFU,0.5 PFU;与同种属的其他甲病毒(辛德毕斯病毒和塞姆利基森林病毒等)和黄病毒(日本脑炎病毒和西尼罗病毒等)无交叉反应;对疑似感染病人样本的检测结果与同期医院临床检测结果一致。由此可见,我们已经成功建立了能同时检测CHIKV和ZIKV的快速核酸检测方法,为以后这两种病毒的检测诊断提供了有效的技术储备。(2)CHIKV结构蛋白E2(CHIKV-E2)单克隆抗体的制备与鉴定使用原核表达、割胶纯化方法获得的CHIKV结构蛋白E2作为免疫原免疫小鼠获得多克隆抗体,使用间接免疫荧光(Indirect immunofluorescen,IFA)和免疫印迹(western blot,WB)对多克隆抗体特异性进行验证。结果表明,以原核表达的CHIKV-E2蛋白作为免疫原免疫小鼠产生的E2抗体能够检测到病毒感染真核细胞中E2蛋白的表达。通过ELISA检测表明经过四次免疫后小鼠血清抗体效价达到1:300,000–1:1,000,000,达到制备单克隆抗体的条件。然后,将免疫小鼠的脾细胞和活化的骨髓瘤细胞(SP2/0)融合获得杂交瘤细胞,使用真核表达E2蛋白的细胞裂解液作为包被抗原,通过ELISA初筛获得15株阳性克隆,并通过IFA验证其中9株能够识别病毒感染细胞内E2蛋白,对这些IFA阳性的细胞进行四轮亚克隆化,最终得到了9株单克隆细胞系。对这些细胞系进行验证,成功制备了高滴度、高特异性的腹水抗体。我们分别对纯化的腹水抗体的中和活性、特异性、抗体亚型及识别抗原表位等特性进行了鉴定。结果表明在制备的这9株抗体中,(a)有5株具有中和病毒的活性;(b)9株抗体中除了6E2外,其他8株都能很好的用于IFA检测;(c)上述9株抗体都可以用于Western blot检测;(d)抗原表位鉴定发现9株亚克隆分别识别E2蛋白的三个不同的domain区;(e)这9株抗体中有两株(4C4,7B7)不仅能检测CHIKV,还和其同属的塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)有交叉反应,而其余的7株都只能特异性的检测到CHIKV,所以这些单抗可能成为潜在的检测诊断和抗病毒药物试剂,也为研究结构蛋白E2的功能提供了良好的实验材料。