论文部分内容阅读
目的:宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,由于其早期症状不明显,患者被诊断时往往已发展至晚期。晚期和复发的宫颈癌患者预后差,可选择的治疗方法也十分有限,因此,寻找新的治疗方法迫在眉睫。SGK1是PI3K下游的信号分子,它的异常活化被证明与多种肿瘤的发生与发展相关,但其在宫颈癌中的作用仍未被证明。有研究表明,敲低SGK1会增加褪膜细胞对氧化性死亡的敏感性,这提示SGK1可能参与细胞氧化还原稳态的调节。氧化还原稳态是维持正常细胞功能和确保细胞存活的基础,已有研究表明治疗性的氧化还原干预可以作为一种新的抗肿瘤策略。本文旨在验证SGK1在宫颈癌中参与氧化还原的调节,并探索其分子机制,为设计氧化还原干预疗法治疗宫颈癌的策略提供依据。方法:体外实验:（1）在四株宫颈癌细胞系中,抑制SGK1（si-RNA敲低或抑制剂GSK650394处理两种方法）并用H2O2刺激细胞,通过检测细胞存活能力以及细胞ROS水平,研究SGK1是否具有抗氧化能力;通过ROS清除剂GSH的使用验证SGK1是否依赖其抗氧化能力促进宫颈癌细胞的存活;（2）通过RNA-Seq将对照细胞与敲低SGK1的细胞的转录组进行比对,并进行GSEA分析以检测SGK1的敲低是否伴随氧化还原相关的信号通路的改变;q RT-PCR验证抑制SGK1对NRF2及其转录靶基因的表达的影响。（3）在宫颈癌细胞中过表达激酶持续活化型或激酶失活型的SGK1（分别为S422D与K127M）,同时敲低NRF2,通过Western Blot分析与q RT-PCR检测SGK1的活性与NRF2表达及活性的关系;在蛋白酶体抑制剂MG132的作用下,检测SGK1的敲低对c-JUN蛋白水平的影响,以验证SGK1调节c-JUN稳定性;在S422D与K127M细胞中敲低c-JUN,检测细胞中NRF2表达水平及活性氧水平,验证SGK1通过SGK1-c-JUN-NRF2信号通路发挥其抗氧化活性;（4）通过Western Blot分析,ROS检测,流式凋亡检测与3D成球培养实验,探究Melatonin与GSK650394的联合处理能使宫颈癌细胞氧化还原失调,并有效的治疗宫颈癌细胞;体内实验:（5）进行ME180细胞的小鼠皮下成瘤实验,检测两药联用是否能有效治疗肿瘤;（6）在给药四天后每组随机选取一只,对各组肿瘤进行免疫组化检测,验证体内实验的结果是否与体外实验相一致,进一步证明治疗策略的可行性;结果:（1）抑制SGK1使宫颈癌细胞的生长能力降低;GSEA结果表明氧化磷酸化信号通路在敲低SGK1的细胞中负向富集,说明SGK1与氧化磷酸化正相关;流式及细胞活力检测的结果表明抑制SGK1会诱导细胞ROS水平上升,并使细胞对H2O2诱导的细胞毒性更加敏感,而GSH的使用逆转了上述现象,说明在宫颈癌细胞中SGK1参与氧化还原的调节,并依赖其抗氧化的作用促进宫颈癌细胞的存活;（2）RNA-Seq结合临床数据库分析发现:在宫颈癌中,SGK1与抗氧化转录因子NRF2的表达显著正相关;Western Blot分析以及q RT-PCR的结果表明:与K127M细胞相比,S422D细胞的NRF2蛋白水平显著上升,且仅在S422D细胞中,NRF2的敲低显著抑制其下游靶标的表达,说明SGK1依赖其活性调节NRF2的表达及转录活性;（3）在MG132的作用下,SGK1的敲低不再下调c-JUN的蛋白水平,提示SGK1正向调节其稳定性;c-JUN的敲低诱导S422D细胞的ROS水平上升,下调NRF2的表达,证明SGK1依赖其活性上调c-JUN的蛋白水平,从而正向调节NRF2的表达;（4）流式凋亡检测以及3D成球实验说明:GSK650394使细胞对Melatonin更敏感,并导致ROS过度累积,继而增加细胞毒性;（5）与体外观察一致,我们的体内异种移植实验表明,褪黑素和GSK650394联合治疗会导致肿瘤产生严重的氧化损伤,并显著缩小肿瘤体积。结论:（1）SGK1依赖其抗氧化能力促进宫颈癌细胞的存活。（2）在宫颈癌细胞中,SGK1通过上调c-JUN的蛋白水平正向调节NRF2的表达及活性。（3）抑制SGK1同时联用具有促氧化活性的Melatonin能诱导宫颈癌细胞内的ROS过度累积并增加细胞毒性。（4）靶向抗氧化SGK1-c-JUN-NRF2信号通路可能是一种有效的、有前景的宫颈癌治疗策略。