甘草内生真菌GRP13活性代谢物研究

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乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)为北方道地药材,也是濒危药用植物,从乌拉尔甘草内生菌中筛选与其含有相同、相似或全新化合物,并采用内生菌发酵的方法工厂化生产乌拉尔甘草活性成分,对保护药用植物资源、创制新药及新型保健食品具有重要意义。选取甘草内生真菌GRP13作为研究对象,以抑菌活性为指标,采用单因素及正交实验相结合的方法对其进行发酵工艺条件的优化,在最佳工艺条件下进行发酵培养,甘草内生真菌GRP13发酵液经硅胶柱分离及D101大孔树脂柱分离后,采用高效液相色谱(HPLC)、MS、核磁共振谱(1H-NMR和13C-NMR)对各晶体物质进行结构鉴定,并进行抑菌活性及抗氧化活性作用研究,主要结果如下:甘草内生真菌GRP13菌株的最佳发酵条件为:碳源为2%(m/v)葡萄糖,氮源为1%(m/v)蛋白胨,培养温度为28℃,摇床转数为140r/min,装液量为50%(v/v),接种量为5%(v/v),初始pH值为7.0,发酵时间为14d。经验证实验证明,采用最佳发酵条件发酵甘草内生真菌GRP13菌株,其抑菌作用与优化前的抑菌活性相比,抑菌效果提高到22.1±0.20mm。10L甘草内生真菌GRP13发酵液浓缩后,分别经乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取,各萃取液进行硅胶柱色谱分离纯化,在乙醚萃取部位分离得到晶体1和2,乙酸乙酯萃取部位得到晶体3,菌丝体分离得到晶体4;10L甘草内生真菌GRP13发酵液进行D101大孔树脂分离纯化,得到晶体5。采用高效液相色谱(HPLC)、MS、核磁共振谱(1H-NMR和13C-NMR)对各晶体物质进行结构鉴定,结果显示:晶体1为苯甲酸,晶体3为pseurotin A,晶体5为甘草素,其中晶体4结构较为复杂,晶体2由于较易氧化且含量极低,没有最终确定其结构。对各晶体物质进行抗菌活性研究,选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌株,结果显示,晶体1的抗菌活性最强,对大肠杆菌的抑菌效果达到33.1mm,对金黄色葡萄球菌的抑菌效果达到30.0mm,其次是晶体5,其对这两株致病菌的抑菌效果分别为30.4mm和29.8mm,晶体3和晶体4抑菌作用相对较弱;各个晶体DPPH抗氧化活性测定结果显示,晶体5对DPPH自由基的消除率达到51.97%,接近相同浓度下Vc的消除率66.85%,而晶体1、3和4对DPPH自由基的清除效果相对较弱。本研究从甘草内生真菌GRP13发酵液中分离得到了苯甲酸、pseurotin A及甘草素,从而说明GRP13菌株是一株具有应用前景的甘草内生真菌。
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