天女木兰MsGID1同源基因克隆及其在拟南芥中的遗传转化

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天女木兰(Magnolia sieboldii K.Koch)种子具有深度生理休眠特性,给播种育苗造成了一定困扰。基于实验室前期研究结果外源赤霉素处理可有效解除天女木兰种子的休眠,本研究以Illumina高通量测序获得的天女木兰种子转录组数据为参考,从赤霉素信号途径起始受体基因(GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1,GID1)入手,通过基因克隆,获得MsGID1同源基因。在此基础上,通过实时荧光定量,探究不同温度(4℃和22℃)对MsGID1同源基因在种子吸胀过程中表达模式的影响;探究外源赤霉素(GA3)和多效唑(PAC)浸种低温层积(4℃)过程中MsGID1同源基因的表达模式。利用双酶切方法构建重组过表达载体;并通过农杆菌介导的花序浸染法实现MsGID1同源基因在拟南芥中的遗传转化。为后续基因功能验证奠定基础,也为赤霉素解除种子休眠提供理论依据。主要结果如下:1.差异基因筛选表明GID1为候选基因,通过克隆获得2个天女木兰赤霉素受体基因MsGID1b和MsGID1c,序列全长分别为996 bp、1 032 bp。二者分别编码331和343个氨基酸,且序列相似性高达84.88%。MsGID1b和MsGID1c编码蛋白的相对分子量分别为37.021 kD和38.363 kD,均是不稳的亲水性蛋白且无信号肽。MsGID1b和MsGID1c属于α/β折叠水解酶超家族,MsGID1b和MsGID1c氨基酸序列中含17个关键位点,其中15个是保守的;含有13个功能结构域,并且MsGID1b中TWVLIS结构域发生了氨基酸替换现象。2.4℃低温吸胀更有利于天女木兰种子MsGID1b和MsGID1c基因表达,且MsGID1c的相对表达量显著高于MsGID1b,推测其在解除种子休眠中发挥主要作用。3.4℃低温层积过程中,外源GA3浸种可增加其内源GA3含量,且随外源GA3浓度升高,MsGID1b和MsGID1c基因被正向调控;层积49d后,与清水处理相比较,种子萌发率增加了10%、22%和44%。随PAC浓度升高,种子内MsGA20OX6(GA 20-oxidase6)、MsGID1b和MsGID1c均显著下调,而MsRGL2(RGA-LIKE 2)无明显变化。层积49d后,PAC处理的种子只裂口但未萌发。外源GA3正向调控了其受体基因GID1s表达,促进二元复合体GA-GID1结合DELLA蛋白,致使DELLA被识别并泛素化降解,加速了GA信号传递,最终解除休眠,促进天女木兰种子萌发。4.本试验成功将MsGID1b和MsGID1c分别构建到真核表达载体pRI–GUS(含CaMV35S)上,命名为pRI-GUS-MsGID1b和pRI-GUS-MsGID1c。并将其分别转入野生型拟南芥(WT)中,获取T0代种子,为后续基因功能验证奠定基础。
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