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研究背景：终末期肝病（End stage liver disease, ESLDs）是指各种肝脏疾病的最后阶段，主要包括急性肝衰竭、慢性肝衰竭和遗传代谢性肝病，其主要临床表现为肝功能严重衰退及门脉高压症等。该病进展迅速，死亡率高。作为治疗该病的最主要手段，肝移植长期以来一直受到供肝极度短缺、手术创伤极大、免疫排斥及免疫耐受困扰、手术费用高昂等影响，大量患者因此丧失了救治机会。以细胞为基础的治疗是一种有效的替代方法。与传统肝移植治疗相比，肝细胞移植（Hepatocyte transplantation，HCT）具有许多优势，例如低侵入性、低免疫原性和可重复执行性，这使其已经用于治疗终末期肝病。细胞移植治疗终末期肝病的关键是细胞类型的选择，但成体肝细胞不能保证持续扩增，加之持续灌注困难，无法大规模应用于临床。相对于上述缺点，干细胞移植作为一种新兴的治疗手段为患者带来了希望，而众多可供选择的干细胞中，胎肝干/祖细胞（Fetal liver stem/progenitor cells, FLSPCs）因多能性、高存活、高增殖、低免疫、小体积而优势明显。要使其应用于临床，其增殖、分化的相关机制就需要深入研究，而如果能够稳定大量的获得FLSPCs，使其在体外增殖，按需分化，并能在体内很好的示踪，则是开展肝脏发育和临床治疗应用研究的基础。研究目的：分离C57BL/6J-EGFP小鼠和F344大鼠的胎肝干/祖细胞，优化培养方案得到高纯度的FLSPCs，探讨其自我增殖能力，及其在体内外向肝细胞和胆管细胞双向诱导分化的潜能。研究方法：1.取孕13d C57BL/6J-EGFP小鼠和孕14d F344大鼠胚胎肝脏，经胶原酶消化和机械分离获得细胞并扩大培养；2.流式细胞术鉴定其干细胞标志物的表达3.RT-PCR及Western blot测定AFP表达；4.分别将FLSPCs经肝细胞生长因子（HGF）及转化生长因子-β（TGF-β）诱导分化后，Real-time PCR测量ALB、角蛋白CK-7、8、19以及Western blot测量ALB、CK-8在诱导前后的表达变化，鉴定其向肝细胞和胆管细胞双向分化的能力；5.经尾静脉注射FLSPCs到肝切除C57BL/6J野生型小鼠体内，观察其在肝内重构肝组织的能力。研究结果：1.流式细胞仪检测分离的FLSPCs表达EpCAM、CD133、CD49f等干细胞标志物；2.RT-PCR和Western blot检测AFP在FLSPCs中的表达显著高于成熟肝细胞的表达，两者比较，差异有统计学意义（t=8.77，5.35，P＜0.05）；3.超低黏附培养皿培养FLSPCs克隆球形成率显著高于同培养条件成熟肝细胞的克隆球形成率，两者比较，差异有统计学意义(t=12.71，P<0.01)；体外HGF诱导FLSPCs分化，ALB、CK-8mRNA表达分别在8、10d到达峰值，与各自第2天比较，差异有统计学意义（t=42.55，25.17，P＜0.05）；两者蛋白表达峰值均出现于第10天，与各自第2天比较，差异有统计学意义（t=175.08，41.69，P＜0.05）；体外TGF-β诱导FLSPCs分化，CK-7、CK-19mRNA在第12d达到高峰，与各自第2天比较，差异有统计学意义（t=12.32，9.09，P＜0.05）；两者蛋白表达峰值均出现于第14天，与各自第2天比较，差异有统计学意义（t=53.89，39.71，P＜0.05）；4.在移植有FLSPCs的肝切除小鼠体内可检测到表达EGFP的成熟肝细胞及胆管细胞。研究结论：本实验通过IV型胶原酶消化及机械分离法获取和纯化胎肝组织中的FLSPCs，其稳定表达干细胞标志，证明所得细胞具有显著的肝干细胞特征和向肝细胞和胆管细胞双向分化的潜能，且在体内研究中拥有良好的示踪性。