近年来肺癌的发病率在全球呈迅速上升趋势,是癌症死亡的重要原因,全世界每年新确诊的肺癌患者达到180万,其中每年超过100万人因肺癌死亡,其死亡率40年间上升近10倍[1,2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的最常见类型、占肺癌的80%左右[3]。目前非小细胞肺癌的治疗手段主要包括:早期的手术治疗,晚期的放化疗、分子靶向治疗、生物免疫治疗及局部介入治疗等等,肺癌患者早期多无临床症状,60%多的患者就诊时因处于晚期或心肺功能差而不能行手术治疗,对于不能手术治疗的患者采用放化疗、局部介入治疗及姑息治疗等,其5年生存率低[4]。随着医学技术的不断进步,人们针对EGFR等基因突变研发了靶向药物[5],显著改善了非小细胞肺癌的治疗现状,有突变基因的患者应用这些靶向药物治疗效果好,但无基因突变患者应用这些药物治疗效果差,而且靶向治疗并非一直有效、这些患者最终都会出现耐药[6]。因此进一步深入研究非小细胞肺癌发病的分子机制、侵袭转移途径、关键信号转导通路,探寻更为有效的肺癌早期诊断、早期治疗手段具有重要意义;如能发现新的肿瘤标志物,早期发现肺癌,并针对发病机制进行干预阻止其进一步侵袭发展,将会有更多患者收益。目前的研究发现肺癌的发病与下列因素有关:1.吸烟:吸烟是肺癌的重要危险因素,烟草中含有各种致癌物质,其中苯并芘为主要的致癌物。2.职业因素:职业接触中的石棉,含坤无机化合物,铬及其化合物,不完全燃烧的煤、油等产生的多环芳烃等是已经确认的职业致肺癌因素。3.空气污染:包括室内小环境及室外大环境污染。4.电离辐射:高剂量电离辐射可引起肺癌。5.饮食与营养:饮食中的维生素A、胡萝卜素等可抑制化学致癌物所诱发的肺癌。6.其他:如肺结核患者发生肺癌的危险性是正常人群的8-10倍,此外病毒感染、真菌产生的毒素、机体免疫功能失衡等因素对肺癌的发生也起到促进作用。7.遗传和基因改变:目前认为肺癌可能是外界环境因素和机体遗传因素相互作用的结果。外界致癌物质可诱发人体内某些癌基因及抑癌基因表达的失衡,抑制癌细胞的凋亡,导致细胞癌变并生长失控,该过程涉及多个基因、通路、细胞因子的参与,其中PI3K/AKT信号通路在肺癌的发生发展中发挥重要作用,该通路的过度活化可促进癌细胞的增殖、侵袭并抑制癌细胞的凋亡[7,8]。AKT又称蛋白激酶B/PKB,是参与PI3K/AKT通道的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是病毒癌基因(v-akt)的细胞同源物,参与调控细胞增殖、存活、分化、粘附、运动等,AKT可被EGFR等几个跨膜受体激活,与配体结合激活后,EGFR募集磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,P13K)至细胞膜,PI3K将细胞膜上的磷脂肌醇二磷酸磷酸化,产生磷脂酰肌醇三磷酸,后者作为第二信使与AKT结合,促进AKT磷酸化,并与多种效应蛋白相互作用将信号从细胞膜导入细胞内,AKT持续活化是发挥其促细胞增殖、抑制细胞凋亡的重要机制[9]。活化的PI3K/AKT信号通路可通过多条途径参与肿瘤的发生和发展[10]:包括激活mTOR、P21cipl、GSK-3、CREB及TSC2等参与癌细胞的增殖;通过Bcl-2家族、细胞凋亡抑制蛋白、Forkhead转录因子、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族等抑制肿瘤细胞的凋亡;通过激活mTOR/p70S6K参与癌细胞的运动、侵袭、转移等。p-AKT是AKT的活化形式,研究发现p-AKT在正常肺组织中基本不表达,而在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高,提示AKT的活化在细胞的癌变过程中发挥重要作用[11],AKT在非小细胞肺癌中异常激活的分子机制仍需进一步探讨。由人γ-synuclein(SNCG)基因编码的γ突触核蛋白(又称为乳腺癌特异性蛋白),是乳腺癌致癌基因及分子标志物[12],与突触核蛋白家族中的α突触核蛋白(SNCA)、β突触核蛋白(SNCB)分别有55.9%和54.3%的同源性,但其染色体定位及功能不同[13]。目前研究发现γ突触核蛋白不仅在乳腺癌组织中高表达,在包括肺癌在内的多种人类癌变组织中也发现了 γ突触核蛋白的异常高表达[14],且随肿瘤进展其表达水平逐渐升高。研究发现[15]γ突触核蛋白启动子区的CpG岛异常甲基化是造成γ突触核蛋白在肿瘤中异常高表达的主要原因,并可通过抑制有丝分裂检查点重要激酶BubR1的功能、导致不正常的细胞分裂促进肿瘤细胞的增殖。γ突触核蛋白的过表达能够促进肺癌的发生、增殖、侵袭及耐药,对非小细胞肺癌组织和正常肺组织中γ突触核蛋白表达的研究显示,非小细胞肺癌组织表达阳性率(46.7%)明显高于正常肺组织(0)且差异有统计学意义[13]。但是γ突触核蛋白在肺癌细胞增殖和存活中的作用机制尚不明确。一些蛋白与AKT结合并调节其激酶活性发挥作用,如在神经元中β突触核蛋白与AKT结合并促进AKT活化,进而保护神经元细胞免受鱼藤酮的毒性损伤[16]。γ突触核蛋白与β突触核蛋白同属突触核蛋白家族且有高度同源性,晚期乳腺癌可同时表达β突触核蛋白、γ突触核蛋白[17]。本研究中,我们探讨了γ突触核蛋白和AKT的相互作用及其在非小细胞肺癌发生发展中的作用及机制。我们首先观察了非小细胞肺癌组织和正常对照组织中γ突触核蛋白、AKT和p-AKT表达的差异,发现非小细胞肺癌组织中γ突触核蛋白及p-AKT表达明显增加,免疫共沉淀等发现γ突触核蛋白与AKT的激酶结构域结合,进一步实验发现γ突触核蛋白过表达可增加AKT磷酸化及活化、促进EGF诱导的癌细胞增殖,抑制星形孢菌素(STR)诱导的细胞凋亡、促进癌细胞存活,并证实了 γ突触核蛋白促进肺癌细胞增殖和存活的作用通过激活AKT来实现。总之,我们发现γ突触核蛋白与AKT相互作用,导致AKT持续活化,促进非小细胞肺癌增殖和存活,我们的研究阐明了 γ突触核蛋白及AKT在肺癌发病机制中的新作用,为非小细胞肺癌的早期诊断和治疗提供新的靶点和理论依据。第一部分Y突触核蛋白与AKT在非小细胞肺癌组织中的表达及两者的关系[目的]观察NSCLC组织与自身癌旁对照组织中γ突触核蛋白、p-AKT、AKT表达的差异,明确γ突触核蛋白与AKT活化之间的关系。[方法]1.Western blot检测NSCLC组织及对照组织中AKT、p-AKT及γ-突触核蛋白表达的差异。2.免疫共沉淀检测人NSCLC组织中γ突触核蛋白与AKT的关系。3.GST pull-down实验明确Y突触核蛋白与AKT结合的结构域。4.SNCG质粒转染H157细胞使γ突触核蛋白过表达,AKT活性检测试剂盒及Western blot检测AKT磷酸化及活性的变化。5.SNCG siRNA敲低H157细胞中γ突触核蛋白的表达,AKT活性检测试剂盒及Western blot检测AKT磷酸化及活性的变化。[结果]1.NSCLC组织中p-AKT、γ突触核蛋白的表达较对照组明显升高,但两组之间总AKT的表达无明显差异,提示NSCLC组织中γ突触核蛋白高表达,AKT通路活化。2.NSCLC组织中γ突触核蛋白与AKT相互结合。3.γ突触核蛋白与AKT全长及a.a.1-408片段结合,与a.a.1-108片段无结合,提示γ突触核蛋白结合AKT的激酶结构域。4.γ突触核蛋白的过表达促进了 AKT的活化。5.敲低γ突触核蛋白的表达后EGF诱导的AKT磷酸化及活化下降。[结论]1.γ突触核蛋白与AKT激酶结构域相结合。2.γ突触核蛋白促进AKT的磷酸化及活化。第二部分γ突触核蛋白通过激活AKT促进非小细胞肺癌细胞增殖和存活的作用研究[目的]进一步探讨γ突触核蛋白通过激活AKT在促进非小细胞肺癌增殖和存活中的作用及机制。[方法]1.使用SNCGsiRNA敲低H157细胞中γ突触核蛋白的表达,应用MTT法及Western blot检测增殖细胞核抗原PCNA表达的变化,观测EGF介导的癌细胞增殖的变化。2.通过SNCG质粒使H157细胞中γ突触核蛋白过表达,应用MTT法及Western blot检测active caspase-3表达变化,观测STR介导的癌细胞凋亡的变化。3.使用AKT siRNA敲低H157细胞中AKT表达,MTT法检测γ-突触核蛋白促癌细胞增殖的变化。4.使用AKT siRNA敲低H157细胞中AKT表达,MTT法检测γ-突触核蛋白对STR介导的细胞毒性的保护作用的变化。[结果]1.敲低γ突触核蛋白的表达后,EGF介导的癌细胞增殖作用显著降低。2.γ突触核蛋白过表达,减弱了 STR介导的癌细胞凋亡作用。3.敲低AKT的表达,γ突触核蛋白的促癌细胞增殖作用减弱。4.敲低AKT的表达,减弱了 γ突触核蛋白对STR介导的细胞毒性的保护作用。[结论]1.γ突触核蛋白在非小细胞肺癌细胞的增殖和存活中起到关键作用。2.γ突触核蛋白的促癌细胞增殖和存活作用是通过激活AKT实现的。