论文部分内容阅读
BcSpll是从灰霉菌(Botrytis cinerea)分泌蛋白质组中发现的一个蛋白激发子,该蛋白属于cerato-platanin家族成员之一,能引起番茄、烟草叶片快速强烈的坏死反应。为明确BcSpll激发番茄免疫反应的分子机制,本文用毕赤酵母和大肠杆菌表达获得了BcSpll重组表达蛋白,重组蛋白渗入番茄植株叶片能引起快速坏死枯斑,并能诱导产生局部和系统诱导抗性；BcSpll激发子能诱导抗病相关基因和蛋白激酶基因转录的上调表达,引起磷酸化蛋白表达谱的变化,通过生物言息学分析了番茄体内磷酸化蛋白组的结构特点并获得了BcSpll诱导表达的特异蛋白激酶和抗病蛋白,具体研究结果如下：1.通过毕赤酵母真核表达体系和大肠杆菌原核表达体系获得了BcSpll重组蛋白,质谱鉴定证明两种表达系统获得的重组蛋白为同一蛋白。两种重组蛋白BcSpll均能引起番茄叶片快速的坏死反应,并具有诱导番茄植株抗病性的功能。重组蛋白注射番茄叶片后,1h即能观察到坏死斑,24 h枯斑更明显。真核表达蛋白和原核表达蛋白诱导番茄抗灰葡萄孢菌的侵染程度分别比对照降低了22.7%和21.8%。由此可见,两种表达系统获得的重组蛋白诱导番茄抗性的活性基本相同,可以用原核表达来替代真核表达获得重组蛋白BcSpll.2.重组蛋白BcSpll调控番茄抗性相关基因Prosystemin,PR-1α、PIⅠ、PIⅡ和蛋白激酶基因TPK1b,SIPK和WIPK的表达,且表现出一定的时序性。荧光定量PCR结果显示,BcSpll处理番茄叶片后12h,SAR标志基因PR-la上调近200倍,24 h后上调倍数仍维持在200倍左右。抗病基因Prosystemin,PIⅠ和PIII在BcSpl1处理后6h上调倍数分别为2.4,9和100倍。12h后,上调倍数分别增至7,400和900倍。此外,BcSpll能引起抗病蛋白激酶基因的上调表达,处理番茄叶片后15 min,WIPK开始上调,6h后,SIPK和WIPK上调倍数分别为5和倍。TPK1b在处理后6h表达上调10倍,24h表达上调17倍。说明BcSpll诱导番茄抗病相关基因和蛋白激酶转录水平上调是其诱导番茄获得性抗性的重要机制之一。3. BcSpl1诱导番茄特异磷酸化蛋白的变化。利用IMAC技术,对蛋白激发子BcSpll引起的磷酸化差异蛋白组学进行分析,鉴定到了来自483个蛋白的871个磷酸化肽段,其中有来自332个蛋白的573个磷酸化肽段被定量,包括5个上调的磷酸化蛋白和49个下调的磷酸化蛋白。通过Motif-X分析,获得了5个保守的motifs,分别为S(ph)P,R**S(ph),S(ph)D*E,S(ph)D*D和T(ph)P。对差异磷酸化蛋白的GO分析发现,番茄体内磷酸化蛋白在细胞代谢过程以及对外界刺激的反应中起着非常重要的作用。另外,研究发现,定位于细胞核的磷酸化蛋白中,鉴定到19种含有RING-H2、C2H2等多种类型锌指结构域的蛋白,这些蛋白可能参与了细胞核内的信号传递和转录调控。同时,检测到36个蛋白激酶,其中9个激酶定位于细胞膜上,另外具有丝、苏／酪氨酸催化活性的激酶共28个。9个膜上的蛋白激酶里,有4个激酶含有LRR结构,属类受体蛋白激酶,2个蛋白激酶含有LysM结构域。