论文部分内容阅读
基因治疗是治疗癌症以及遗传疾病的有效手段,随着人类基因组计划的进展,基因治疗也用于治疗更多新的疾病,如皮肤修复,骨缺损修复等。目前基因载体仍然是制约基因治疗发展的瓶颈。基因载体主要包括病毒性基因载体和非病毒性基因载体。病毒性基因载体存在较强的免疫原性,插入突变性,应用受到限制;非病毒性基因载体主要以阳离子聚合物为主,但是其毒性大和转染效率低的问题亟待解决。大量的文献报导证明在基因载体设计中引入生物相容性好、可降解的结构可以明显降低毒性和提高转染效率。聚氨基酸具有优异的生物相容性和生物降解性,并且具有与生物体蛋白质相似的二级结构,具有一定的生物学功能。其中聚天冬氨酸(PAsp)合成简单,易于修饰和功能化,为新型高性能基因载体的构建提供了多样化的途径。本论文主要研究内容如下:纳米纤维素(CNC)是一种天然多糖纳米颗粒,具有良好的生物相容性和稳定的纳米尺寸,有利于纳米尺寸基因载体的构建。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)与乙二胺(EA)的开环反应可以构建富含羟基的阳离子载体(PGEA),具有较好的转染性能。在第二章中,基于接枝有组装单元二羟基萘(Np)修饰的PAsp衍生物的CNC(CNC-PAsp-EA/Np)和接枝有组装单元紫精(MV)的PGEA(MV-PGEA)通过经典的葫芦脲[8](CB[8])三元主客体组装体系构建了棒状超分子纳米组装体CNC@CB[8]@PGEA,用于递送不同的抑癌RNA实现对肝癌的基因治疗。CNC@CB[8]@PGEA载体结合了CNC和PGEA的优点,更重要的是,PAsp有利于纳米组装体CNC@CB[8]@PGEA在细胞内的降解和解组装。CNC@CB[8]@PGEA可以有效络合表达miR-101的质粒pc3.0-miR-101和表达lncMEG3的质粒pc3.0-MEG3,并在肝癌细胞HepG2中高水平表达,展现出良好的体外抗肿瘤能力。与含有PGEA的组装单元MV-PGEA相比,CNC@CB[8]@PGEA表现出了较优异的转染性能。此外,与单独递送 pc3.0-miR-101 和 pc3.0-MEG3 的体系相比较,CNC@CB[8]@PGEA介导的pc3.0-miR-101/pc3.0-MEG3共递送系统发挥作用展现出了较好的体内外抑制肝癌的效果。聚轮烷是一类典型的超分子聚合物,其解组装有助于促进质粒的释放,适合用于构建可降解基因载体。在第三章中,构建了一种新型的ABA-三嵌段富含羟基的阳离子聚轮烷(PP-PGEA)作为基因递送载体。PP-PGEA是由穿在PEG骨架上的CD-PGEA作为B段,可降解的起封端作用的PAsp作为A段构成的,其中CD-PGEA表示环糊精(CD)上接枝三条PGEA链。PAsp的降解会促进CD-PGEA的滑落,从而促进质粒的释放提高转染效率。与CD-PGEA相比,PP-PGEA能更有效地缩合质粒,在HepG2和C6(大鼠胶质瘤细胞)两种细胞中具有较高的转染性能。此外证明了 PP-PGEA/p53具有优异的体内外抗肿瘤能力。妥布霉素(Tobramycin)是氨基糖苷类抗生素,在临床上主要用于由革兰阴性菌绿脓杆菌及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌等敏感细菌引起的创面感染及软组织感染。在第四章中,通过妥布霉素引发单体BLA-NCA的开环聚合反应制备了妥布霉素接枝聚天冬氨酸苄酯(T-PBLA),随后通过T-PBLA与妥布霉素和ED的胺解反应构建了新型基因载体T-PAsp-T(TPT)。TPT具有优异抗菌性能,同时PAsp的降解可以促进质粒的释放。证明了 TPT能够将基因缩合成适合细胞内吞的纳米颗粒,并在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)和小鼠成纤维细胞(L929)两种细胞中具有较高的基因转染效率。此外,还证明了TPT对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抗菌能力。在此基础之上,证明了 TPT/pEGF递送系统能够促进NIH3T3和L929的增殖和迁移,并且在大鼠皮肤创面模型上展现出了较好的抗菌能力和促进创面愈合的作用。综上所述,本论文基于可降解PAsp构建了两类以多糖为骨架接枝PGEA的高性能基因载体用于对癌症的治疗。通过体外细胞和体内动物实验证明了棒状超分子纳米组装体(CNC@CB[8]@PGEA)和ABA-三嵌段聚轮烷(PP-PGEA)载体材料的高性能。同时,通过体内外实验证明了基于PAsp构建的新型氨基糖苷类基因载体(TPT)能够实现皮肤创面抗菌及促进愈合的协同治疗。以上三类高性能新型基因载体的构建对于实现基因载体的应用具有重要意义。