论文部分内容阅读
【研究背景】恶性肿瘤是临床上的常见病和多发病，其发生率和死亡率呈现逐年上升趋势。造成肿瘤患者死亡的主要原因是转移和复发，迄今没有满意的治疗方法。近年来越来越多的研究表明，SHP-2的激活突变和过分表达可能与肿瘤的发生和转移密切相关，但其在肿瘤中的发生发展、演化和转移中的作用机制尚未明确。SHP-2是一种含有2个Src同源结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶，属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员之一，在调节信号转导及介导各种生物学过程中具有非常重要的作用[1]。酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶和蛋白酪氨酸磷酸酶共同控制，参与调节多种重要的细胞生命过程。早期针对PTPs的研究，重点是在于对PTKs的拮抗作用，以期发现较为重要的抑癌基因。其中，人10号染色体缺失磷酸酶及张力蛋白同源体(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN，MMAC1，TEP-1)的发现，对肿瘤相关领域的研究具有里程碑式的意义。随着研究的深入，包括SHP-2在内的多种PTPs超家族成员作为信号转导的正向调节因子被发现，他们在正常细胞的生长分化以及肿瘤细胞的增殖、粘附、转移过程中起着至关重要的作用。SHP-2相关的癌基因结构及功能的研究正在不断的深化。细胞生存与凋亡共同维持着机体的正常生长发育及内环境的稳定,生长因子介导的细胞信号转导通路在这一相互作用过程中起着重要的调控作用。而细胞的很多生物学过程包括生长、增殖和凋亡等都由酪氨酸磷酸化调节。SHP-2作为一种广泛表达的胞浆蛋白,参与多种细胞因子和生长因子介导的信号转导通路,如Ras-Raf-MAPK、JAK-STAT、PI3K/Akt途径。研究表明,在大多数情况下,尽管SHP-2是一种酪氨酸磷酸酶,但在受体PTK的转导通路中起正调节作用。近年来，SHP-2突变在实体瘤、白血病和努南综合征中陆续被发现，是最早被定义为癌基因的酪氨酸磷酸酶[2]。SHP-2已成为重要的抑癌靶点，寻找和发现有效抑制SHP-2突变的药物已经成为治疗肿瘤的重要方向。目前对SHP-2有高效特异性抑制作用的小分子抑制物还有很大的研发空间。经过长期研究，我实验室初步筛选出三类结构式九个化合物可能与SHP-2分子结构相结合，或可抑制其异常增高的磷酸酶活性。其中三类具有代表性的化合物分别命名为#162、#216、#220化合物。但是，对于此类化合物是否能特异性的抑制SHP-2活性显著增强的肿瘤细胞目前还没有相关文献报道。本实验试图合成此类化合物，并检测其对SHP-2突变的肿瘤细胞的影响，为此类药物的研发提供参考依据。【研究方法】为了研究目标化合物对SHP-2高表达的肿瘤细胞的影响，本论文首先合成了目标化合物#216：4-[（6-溴代-4-氧代-2-硫代-1，2，3，4-四氢喹唑啉）甲基]-N-（4-氨磺酰基苯乙基）苯甲酰胺及其衍生物4-[（6,8-溴代-4-氧代-2-硫代-1，2，3，4-四氢喹唑啉）甲基]-N-（4-氨磺酰基苯乙基）苯甲酰胺（如图1）。根据逆合成法将目标产物分解为三个合成子溴代-2-氨基苯甲酸、对异硫氰甲基苯甲酸甲酯和4-氨乙基苯磺酸酰胺（如图2）。拟以邻氨基苯甲酸为原料通过溴代反应合成化合物溴代-2-氨基苯甲酸；以对氨基苯甲酸为原料经酯化，取代以及盖布瑞尔反应合成化合物对异硫氰甲基苯甲酸甲酯；以苯乙胺为原料经乙酰化、氯磺化、氨化以及水解等反应合成化合物4-氨乙基苯磺酸酰胺。然后将化合物溴代-2-氨基苯甲酸、对异硫氰甲基苯甲酸甲酯和4-氨乙基苯磺酸酰胺经环合、水解、缩合反应合成目标产物。(如图3)。然后分别用两种目标化合物来处理SHP-2磷酸酶活性异常增高的肿瘤细胞来鉴定它对SHP-2酪氨酸磷酸酶的高效特异性抑制作用并讨论其可能的机制。【研究结果】（1）成功合成#216号化合物4-[（6-溴代-4-氧代-2-硫代-1，2，3，4-四氢喹唑啉）甲基]-N-（4-氨磺酰基苯乙基）苯甲酰胺及其衍生物4-[（6,8-溴代-4-氧代-2-硫代-1，2，3，4-四氢喹唑啉）甲基]-N-（4-氨磺酰基苯乙基）苯甲酰胺。其结构经1H-NMR和ESI-MS确证。（2）优化合成路线，提高产率，降低成本。（3）鉴定了#216化合物及其衍生物对SHP-2活性异常增高的肿瘤细胞增殖能力抑制作用，证明#216化合物及其衍生物可有效地抑制SHP-2激活突变的肿瘤细胞的增殖能力，并呈现时间和浓度依赖性。【结论】（1）成功合成#216化合物4-[（6-溴代-4-氧代-2-硫代-1，2，3，4-四氢喹唑啉）甲基]-N-（4-氨磺酰基苯乙基）苯甲酰胺及其衍生物4-[（6,8-溴代-4-氧代-2-硫代-1，2，3，4-四氢喹唑啉）甲基]-N-（4-氨磺酰基苯乙基）苯甲酰胺。运用柱层析技术对目标化合物进行纯化。应用熔点测定、核磁共振氢谱和质谱等检测确认了其结构。（2）#216化合物及其衍生物的合成方法简单易行，很多方法都是首次应用，而且毒性较小，产率较高，有利于实验室合成研究。其合成方法在国内外文献中均无报道，为此类化合物的合成提供了依据和参考。（3）通过实验验证了#216化合物及其衍生物对SHP-2酪氨酸磷酸酶高效、特异性的抑制作用，从而对SHP-2活性异常增强的肿瘤细胞的产生增殖抑制作用。