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背景:胰腺癌是人类消化系统中恶性程度高、病死率至今仍居高不下的恶性肿瘤。因其肿瘤细胞高度恶性增殖,恶性侵袭迁移以及特殊的解剖位置,在临床中病程发展迅速且手术切除率低下,导致临床预后极差。因此,迫切需要深入研究胰腺癌高度增殖、恶性侵袭及转移的发病机制,探寻其关键的致病因子及信号传导通路,这对胰腺癌患者的早期诊断、分子靶向治疗以及预后的改善有着重大的研究意义。TMEFF2基因是包含一个表皮生长因子(EGF)样结构域和两个卵泡抑素样(Follistatin)结构域的I型跨膜蛋白。有研究显示,TMEFF2在食道癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌及胆囊癌等多种恶性肿瘤组织中显著低表达,并具有显著抑癌基因的作用,影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。但到目前为止,国内外尚缺乏TMEFF2在胰腺癌中表达的相关研究,且其相关作用机制仍不清楚。本文从临床胰腺癌组织标本、体外细胞学实验以及裸鼠皮下移植瘤模型分层展开,深入探讨TMEFF2在胰腺癌发生与发展中的作用及其可能的机制,希望为胰腺癌的发病机制及临床治疗提供新的理论基础及分子靶点。目的:1、研究TMEFF2基因在五种人胰腺癌细胞株及临床胰腺癌组织标本中的表达水平;初步探讨TMEFF2的表达水平与患者临床病理参数及其分期之间的相关性。2、通过体外细胞学实验和动物体内实验,研究TMEFF2基因对胰腺癌细胞增殖、凋亡以及迁移侵袭和EMT(Epithelial–Mesenchymal Transition)的影响。3、研究TMEFF2基因是否通过MAPK信号传导通路影响和调控胰腺癌细胞增殖以及侵袭和迁移的分子机制。方法:1、依次采用q RT-PCR和Western Blot方法,从m RNA和蛋白水平分别检测五种人胰腺癌细胞株及人正常胰腺导管上皮细胞中的TMEFF2基因的表达水平;临床收集胰腺癌患者的癌组织标本(36例)及其对应的癌旁组织标本,分别通过q RT-PCR、Western Blot、免疫组化等方法检测样本中TMEFF2的表达水平,并研究TMEFF2的表达水平与患者临床病理参数以及其分期之间相关性。2、过表达TMEFF2质粒转染胰腺癌细胞株上调TMEFF2的表达,并将胰腺癌细胞株分为过表达TMEFF2组和转染空载体的阴性对照组(NC);采用CCK-8细胞增殖实验、集落形成分析、q RT-PCR、Western Blot以及Transwell细胞迁移及侵袭实验,检测过表达TMEFF2对胰腺癌细胞生物学行为的影响。利用转染的胰腺癌细胞株,构建裸鼠皮下移植瘤模型,体内验证过表达TMEFF2对胰腺癌瘤体生长及增殖的影响。3、采用Western blot方法初步检测过表达TMEFF2对MAPK信号通路中JNK和P38两种蛋白分子磷酸化及表达水平的影响。构建稳转染TMEFF2 si RNA的胰腺癌细胞株,采用SB203580处理细胞,然后分别通过CCK-8细胞增殖实验、集落形成分析实验、Transwell细胞迁移侵袭实验检测p38 MAPK抑制剂对胰腺癌细胞生物学行为的影响。采用Western blot检验学方法,检测过表达TMEFF2对Ras/Raf/MEK/ERK信号传导通路中主要蛋白分子表达水平和磷酸化的影响。结果:1、在五种人胰腺癌细胞株中,TMEFF2基因均呈现不同程度的低表达(p<0.001);TMEFF2基因在临床患者的胰腺癌组织中,其表达水平显著低于癌旁相应的正常胰腺组织(p<0.001)。TMEFF2基因表达的水平与患者肿瘤癌灶的大小、临床病理分期、肿瘤分化程度高度相关,而与患者的年龄、性别以及有无远处转移未见明显相关性;随着肿瘤恶性进展及其临床分期的增加,肿瘤组织中TMEFF2基因的表达水平逐渐减少。2、当转染过表达TMEFF2的慢病毒质粒后,两种胰腺癌细胞株(ASPC1、Panc1)的克隆以及增殖能力明显受到抑制;细胞的迁移和侵袭能力明显减弱;另外,与NC对照组相比,TMEFF2过表达能显著上调细胞上皮源性标记物相关蛋白(E-cadherin)的表达,同时抑制间质表型标记物相关蛋白(Snail,Vimentin,MMP-2和MMP-9)的表达。而进一步的动物体内实验结果证实,与阴性对照组相比(NC),TMEFF2过表达组的瘤体体重明显减轻(p<0.001)、瘤组织中细胞的增殖水平明显下降(p<0.001)而细胞的凋亡水平却显著增加(p<0.001)。3、与NC组相比,过表达TMEFF2组MAPK信号通路中p-JNK/JNK和p-P38/P38的比例明显下降,并且Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中Ras,p-Raf/Raf,p-MEK/MEK,p ERK/ERK的表达水平明显降低。当细胞转染TMEFF2 si RNA慢病毒敲低TMEFF2表达后,胰腺癌细胞的增殖、克隆能力与细胞迁徙、侵袭能力明显上调,细胞中E-cadherin蛋白表达水平显著下降,而MMP-2、MMP-9、Snail和Vimentin蛋白分子的表达水平明显升高。但经p38 MAPK抑制剂处理后,敲低TMEFF2表达的胰腺癌细胞其增殖、克隆能力与细胞迁移和侵袭能力显著下降,而E-cadherin蛋白的平均表达水平明显升高,MMP-2、MMP-9、Snail和Vimentin蛋白分子的表达水平显著下降。结论:1、TMEFF2基因在临床胰腺癌标本以及五种人胰腺癌细胞株中低表达;胰腺癌患者的临床病理分期越晚,TMEFF2基因的表达越低,且与胰腺癌瘤体的大小、肿瘤分化程度相关。2、体外实验中,过表达TMEFF2可抑制两种胰腺癌细胞株(Panc1、ASPC1)的克隆、增殖能力,以及迁移侵袭和上皮-间质转化;过表达TMEFF2可抑制动物体内胰腺癌组织的增殖水平并能促进癌细胞凋亡。3、TMEFF2基因通过阻碍MAPK信号传导通路的磷酸化进程来抑制胰腺癌细胞的增殖水平以及迁移和侵袭行为。