论文部分内容阅读
背景弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤,在细胞学、基因表达及免疫表型等方面都具有较大的差异。目前DLBCL的一线治疗主要是化疗联合利妥昔单抗等生物靶向治疗,这种治疗方法能够使40%-60%的患者达到完全缓解,但仍存在一部分患者经标准一线治疗后复发或难治。对于复发难治的DLBCL患者,探索新的分子靶点将对DLBCL的诊疗及预后有着极其重要的意义。研究发现DLBCL的发病和进展与微小RNA（micro RNA,miRNA）的关系密切,并且能够成为DLBCL诊疗及预后监测的分子生物标志物。国内外研究发现miR-199a-3p在一些恶性肿瘤中高表达,并能够影响细胞的生物学功能特性,但目前关于miR-199a-3p在DLBCL中的相关研究较少,因此本文通过对miR-199a-3p在DLBCL中的表达及生物学功能进行研究,从而探索miR-199a-3p在DLBCL发病和进展中的作用。目的1.研究弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系和正常人淋巴细胞中miR-199a-3p的表达情况,探讨miR-199a-3p在弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系中异常表达的意义。2.研究miR-199a-3p对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系LY8、U2932和EJ-1增殖凋亡、迁移侵袭和克隆形成等细胞学功能的影响。方法1.采用qRT-PCR法测定miR-199a-3p在DLBCL细胞系LY8、U2932、EJ-1中的表达情况,以正常人淋巴细胞作为对照,并对差异表达的miR-199a-3p进行统计学分析。2.通过构建慢病毒载体下调DLBCL细胞系中miR-199a-3p的表达量,将基因下调后的细胞分为三组,即miR-199a-3p inhibitor组、miR-199a-3p inhibitor NC组和control组;并通过qRT-PCR法验证慢病毒载体转染后的miR-199a-3p表达水平变化。3.使用CCK-8法细胞增殖实验检测miR-199a-3p对DLBCL细胞系增殖能力的作用,同时利用流式细胞术测定miR-199a-3p对DLBCL细胞系凋亡的影响。4.运用克隆形成能力试验明确miR-199a-3p对DLBCL细胞系克隆形成能力的作用,同时利用Transwell迁移侵袭实验测定miR-199a-3p对DLBCL细胞系迁移侵袭能力的作用。5.通过Starbase数据库检索miR-199a-3p的靶基因,利用蛋白作用数据库STRING检索与Bcl-2和c-MYC相互作用的蛋白;Western Blot实验检测慢病毒转染DLBCL细胞系前后Bcl-2和c-MYC蛋白的表达情况,从而推测miR-199a-3p影响DLBCL发生发展可能的机制。结果1.qRT-PCR检测结果显示,DLBCL细胞系EJ-1、LY8、U2932中miR-199a-3p的表达量明显高于正常人淋巴细胞,差异具有统计学意义（P﹤0.05）。2.慢病毒载体成功转染DLBCL细胞系后,经qRT-PCR检测发现miR-199a-3p inhibitor组的miR-199a-3p表达量明显降低（P﹤0.05）,而miR-199a-3p inhibitor NC组的miR-199a-3p表达量无显著变化（P﹥0.05）。3.CCK-8法细胞增殖实验表明,伴随培养时间的延长miR-199a-3p inhibitor组的OD值显著下降,与control组和miR-199a-3p inhibitor NC组相比,差异具有统计学意义（P﹤0.05）,而control组和miR-199a-3p inhibitor NC组相比,差异无统计学意义（P﹥0.05）。4.流式细胞术检测miR-199a-3p inhibitor组、miR-199a-3p inhibitor NC组及control组的凋亡率发现,三组细胞的凋亡水平在统计学上有差异（P﹤0.05）。5.Transwell迁移试验测定显示,miR-199a-3p inhibitor组下层小室的细胞数量明显低于miR-199a-3p inhibitor NC组和control组,差异具有统计学意义（P﹤0.05）,而miR-199a-3p inhibitor NC组和control组的下层小室细胞数量无明显差别（P﹥0.05）。6.克隆形成实验显示,miR-199a-3p inhibitor NC组和control组的克隆能力无显著差异（P﹥0.05）,但和miR-199a-3p inhibitor组相比,miR-199a-3p inhibitor组的克隆能力明显减弱（P﹤0.05）。7.检索Starbase数据库发现miR-199a-3p作用的靶基因有BCL2L11、BID、PMAIP1和MAX,在STRING数据库发现与BCL-2和c-MYC作用的蛋白也包括BCL2L11、BID、PMAIP1和MAX,其中BCL2L11与Bcl-2相关性最高;Western Blot实验表明,miR-199a-3p inhibitor组的Bcl-2蛋白表达下降,与miR-199a-3p inhibitor NC组和control组相比,差异具有统计学意义（P﹤0.05）,而c-MYC蛋白转染前后表达量无明显变化（P﹥0.05）。结论1.miR-199a-3p在DLBCL细胞系中呈高表达,抑制miR-199a-3p表达后可降低肿瘤细胞的增殖、迁移及克隆形成能力,并促进其凋亡。2.在DLBCL细胞系中,Bcl-2可能受miR-199a-3p/BCL2L11通路的调控。