研究背景与目的:人工关节置换术失败的一个重要原因是由钛颗粒刺激的假体周围骨溶解和随后的人工关节无菌性松动。本研究的目的是研究鱼藤素对破骨细胞分化和由钛颗粒介导的骨溶解的影响。我们已经证明,从豆科植物中提取的天然成分鱼藤素对由钛颗粒刺激的小鼠颅盖的溶解具有显着的抑制作用。进一步的组织学分析表明,预防钛颗粒诱导的骨溶解的关键是抑制破骨细胞的分化和功能。我们发现鱼藤素可以通过诱导核因子-κB受体激活剂配体(RANKL)来达到减少破骨细胞生成,限制破骨细胞F-肌动蛋白环形成和减弱骨吸收。此外,鱼藤素可以明显降低V-ATP酶D2(Atp6v0d2)等破骨细胞特异性基因的表达。我们的实验也证实鱼藤素可以通过减弱AKT和MAPK信号通路从而抑制破骨细胞的生成和功能。总的来说,这些数据表明鱼藤素是预防和治疗假体周围骨溶解和其他破骨细胞相关溶骨性疾病的潜在的天然药剂。实验方法:(1)体外实验:1)为测定鱼藤素对破骨细胞分化和功能的影响,我们取了 4-6周龄C57/BL6小鼠双侧股骨与胫骨取骨髓来源的单核巨噬细胞(bone marrow macrophages,BMMs),第一步消除鱼藤素对BMMs的毒性作用影响,我们利用CCK8试剂盒检测骨髓来源单核巨噬细胞的增殖实验。其后,我们用不同浓度鱼藤素对RANKL诱导的BMMs向破骨细胞分化进行药物干预治疗,通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)观察破骨细胞分化形态学状态,TRAP染色阳性且细胞核数量≥3个核的细胞视为破骨细胞,并且对破骨细胞计数,以此观察鱼藤素对破骨细胞分化的影响。2)再次使用不同浓度的鱼藤素对RANKL诱导的破骨细胞的分化过程进行药物干预治疗,利用定量即时聚合酶链锁反应技术(Real-time PCR)来测定破骨细胞特异性基因的表达状况。3)下一步验证鱼藤素对RANKL诱导的破骨细胞的骨吸收功能的影响。我们应用羟基磷灰石涂板(骨板),来观察分析鱼藤素对破骨细胞骨吸收功能的影响。4)为了探讨鱼藤素对RANKL诱导破骨细胞分化和骨吸收功能影响的相关信号通路的调控作用,我们通过蛋白免疫印迹(Western blot)实验方法,检测鱼藤素对RANKL诱导的MAPK信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-AKT信号通路重要信号蛋白磷酸化的影响。通过前期实验以确定鱼藤素可以有效抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收功能的基础上,我们进一步分析鱼藤素对钛颗粒诱导的小鼠颅盖骨溶解缺损的作用。(2)体内实验:钛颗粒诱导小鼠颅盖骨溶解模型(Ti-particle):为了排除雌激素对破骨细胞的影响作用,体内实验选取8到10周龄雄性C57/BL6小鼠32只随机分配为4个实验组,分别设定为空白对照组(PBS组),钛颗粒组(Ti-particle),低药物浓度组(钛颗粒+低浓度鱼藤素),高药物浓度组(钛颗粒+高浓度鱼藤素)。17天后收集小鼠颅盖骨,通过Micro-CT扫描和病理切片组织形态学分析实验结果。实验结果:(1)体外实验:1)鱼藤素对破骨细胞分化有明显的抑制作用,并且对破骨细胞前体细胞没有毒性作用;2)鱼藤素可以有效抑制破骨细胞特异性基因的表达;3)鱼藤素可以通过抑制破骨细胞F-actin环的形成从而抑制骨吸收功能;4)鱼藤素通过PI3K-AKT和p38基因通路调控破骨细胞分化(2)体内试验:鱼藤素可以有效防治钛颗粒诱导得小鼠颅盖骨破损。实验结论:鱼藤素可以有效抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能,从而防治钛颗粒诱导的假体周围骨溶解。