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目的:肾癌不仅是最常见的肾脏肿瘤也是泌尿系统最高发的恶性肿瘤之一,其最主要的病理分型为肾透明细胞癌。由于肾癌早期症状隐匿,初诊患者有30%的几率已出现肿瘤转移。目前,手术切除仍是局限性肾癌最有效的治疗方式,然而依然有25%的患者术后面临着肿瘤复发或转移。另外,难以差强人意的客观反应率和耐药现象的出现是治疗转移性肾癌一线药物酪氨酸酶抑制剂在实际应用中无法回避且难以克服的挑战。转移性肾癌患者的预后极差。因此,深入挖掘肾透明细胞癌转移过程中的相关分子机制并发现针对转移性肾癌的新诊治靶点具有十分重要的意义。整合素作为一类介导细胞与细胞外基质作用与沟通的跨膜受体家族蛋白,在许多疾病的发生发展中扮演着举足轻重的角色。整合素beta 4（ITGB4）是整合素家族一员,其具有非常长的胞内结构域及强大的信号传导功能。文献报道ITGB4可促进数种肿瘤细胞的转移,但其在肾透明细胞癌中的表达及功能尚未被报道。m6A指N6-甲基化腺苷,是绝大多数真核生物中最丰富的RNA修饰形式之一。m6A修饰在“写码器”、“消码器”与“读码器”三种类型基因的共同调控下影响RNA的分布、剪接、成熟、降解、翻译及其他特性。近期陆续有文献报道,m6A修饰显著地影响肾透明细胞癌的转移,但该过程中更深入的机制有待继续探究。因此,探究ITGB4在肾透明细胞癌转移中的作用以及其于m6A修饰之间所存在的潜在联系既可拓展我们对该RNA修饰形式的认知又可为该疾病的诊治提供新的方向。研究方法:1、利用TCGA与GEO公共数据库中相关转录组数据,通过生物信息学分析检测ITGB4在肾透明细胞癌中的表达情况以及其与该肿瘤临床病理特征以及患者预后的相关性。收集临床标本,分别利用实时定量PCR（qRT-PCR）实验与免疫印迹实验检测ITGB4 mRNA与蛋白在肾透明细胞癌组织及配对的癌旁正常肾组织中的表达水平。分别敲减与过表达ITGB4后,体外实验探究肾癌细胞迁移、侵袭能力的变化,免疫印迹实验检测细胞中上皮间质转化相关蛋白的表达变化。体内实验探究过表达ITGB4后肾癌细胞在裸鼠体内转移能力的改变。2、生物信息学分析m6A写码器METTL3与METTL14在TCGA数据库的肾透明细胞癌中的表达情况以及其与该肿瘤临床病理特征以及患者预后的相关性。免疫印迹实验检测METTL3与METTL14蛋白在肾透明细胞癌组织及配对的癌旁正常肾组织中的表达水平。使用m6A定量试剂盒检测肾透明细胞癌组织及配对的癌旁正常肾组织中的m6A总含量。在肾癌细胞系中敲减METTL3并使用免疫印迹实验检测ITGB4蛋白表达变化。分别沉默和过表达METTL14后,利用免疫印迹实验检测肾癌细胞中ITGB4蛋白含量的变化,通过qRT-PCR实验检测ITGB4 mRNA的表达变化。使用转录抑制剂处理细胞并通过qRT-PCR实验分别检测敲减与过表达METTL14后ITGB4 mRNA降解速率的变化。通过文献阅读及核酸序列分析寻找ITGB4 3’UTR中m6A的潜在修饰位点。在肾癌细胞中改变METTL14表达后,利用RNA甲基化免疫共沉淀（Me RIP）实验检测ITGB4 3’UTR中m6A修饰含量的变化,并通过双荧光素酶报告基因实验分别检测野生型与突变型ITGB4 3’UTR的荧光素酶活性。生物信息学分析检测公共数据库的肾透明细胞癌组织与正常肾组织中ITGB4与多种m6A写码器及消码器之间的表达相关性。免疫印迹实验检测干扰ITGB4表达对沉默METTL14所介导的EMT与PI3K/AKT信号通路变化的回复效果。体外实验检测干扰ITGB4表达对沉默METTL14所介导的肾癌细胞迁移与侵袭能力变化的回复效果。体内实验检测敲减ITGB4对沉默METTL14所介导的肾癌细胞在裸鼠体内转移能力改变的回复效果。3、生物信息学分析公共数据库的肾透明细胞癌组织与正常肾组织中ITGB4与多种m6A读码器的表达相关性。在肾癌细胞系中敲减m6A读码器IGF2BP2并使用免疫印迹实验检测ITGB4蛋白表达变化。分别沉默和过表达m6A读码器YTHDF2后,利用免疫印迹实验检测肾癌细胞中ITGB4蛋白含量的变化,通过qRT-PCR实验检测ITGB4 mRNA的表达变化。使用转录抑制剂处理细胞并通过qRT-PCR实验分别检测敲减与过表达YTHDF2后ITGB4 mRNA降解速率的变化。利用RNA免疫共沉淀（RIP）实验检测肾癌细胞系中YTHDF2蛋白与ITGB4 mRNA的结合情况。免疫印迹实验检测敲减YTHDF2对过表达METTL14后ITGB4蛋白表达变化的回复效果。研究结果:1、公共数据库中,ITGB4的高表达与肾透明细胞癌的发生、进展及患者不良预后相关。ITGB4 mRNA与蛋白在我们收集的肾透明细胞癌组织中均显著表达上调。ITGB4表达的降低与升高可分别抑制与促进肾癌细胞在体外的迁移、侵袭。在肾癌细胞中敲减ITGB4可导致N-cadherin的减少与E-cadherin的增多,而过表达ITGB4后会出现相反现象。稳定过表达ITGB4的肾癌细胞与阴性对照组相比在裸鼠体内具有更高的转移效率。2、TCGA数据库中,METTL3与METTL14的低表达与肾透明细胞癌的发生、进展及患者不良预后相关。METTL3与METTL14蛋白在我们收集的肾透明细胞癌组织中均显著表达下调。肾透明细胞癌组织中m6A总含量下降。ITGB4蛋白表达不受METTL3的影响。沉默与过表达METTL14分别可上调与下调ITGB4蛋白与mRNA的表达以及ITGB4 mRNA的稳定性。ITGB4 3’UTR中存在一个潜在的m6A修饰位点。ITGB4 3’UTR可被m6A修饰,敲减与过表达METTL14可分别降低与上调该修饰水平。METTL14可抑制野生型ITGB4 3’UTR的荧光素酶活性,对突变m6A位点的ITGB4 3’UTR的荧光素酶活性无影响。在肾透明细胞癌组织及正常肾组织中,ITGB4与METTL14呈显著的表达负相关。沉默METTL14可促进肾癌细胞的EMT、PI3K/AKT信号激活、迁移、侵袭与转移,敲减ITGB4后此现象被显著回复。3、肾透明细胞癌组织及正常肾组织中,ITGB4与YTHDF2呈表达负相关,与IGF2BP2呈表达正相关。ITGB4蛋白表达不受IGF2BP2影响。沉默与过表达YTHDF2分别可上调与下调ITGB4蛋白和mRNA的表达以及ITGB4 mRNA的稳定性。YTHDF2蛋白可与ITGB4 mRNA结合,其结合强度随METTL14的沉默降低,随METTL14的过表达增强。METTL14过表达后ITGB4蛋白含量减少,再敲减YTHDF2后此现象被显著而部分地回复。结论:1、ITGB4的高表达与肾透明细胞癌的发生发展以及患者的不良预后相关。ITGB4可促进肾癌细胞的迁移、侵袭、转移及EMT。2、METTL14通过m6A修饰ITGB4 3’UTR促进ITGB4 mRNA的降解并下调其表达,从而抑制肾癌细胞的转移能力。3、YTHDF2依赖于METTL14所介导的m6A修饰与ITGB4 mRNA结合,进而促进后者的降解并抑制其表达。