黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种常见的许多重要农作物以及动物的共同致病菌,其在侵染宿主过程中能产生强致癌化合物黄曲霉毒素（Aflatoxin）。黄曲霉毒素的合成是一个极其复杂、而且受多个因素调控的过程。黄曲霉给农业生产和人类健康带来巨大的威胁。目前研究表明,cAMP通路参与了曲霉的无性繁殖和杂色曲霉素的合成。为了研究cAMP信号途径是否也参与调控黄曲霉毒素代谢以及致病力,本文对cAMP/PKA通路中的相关基因在黄曲霉生长发育、黄曲霉毒素合成代谢以及致病过程中的作用进行了系统的研究,研究结果如下:G蛋白调控因子RGS（Regulator of G protein signaling）在G蛋白信号通路的上游中起到负调节的作用。本研究通过生物信息学手段,在黄曲霉菌中鉴定到6个RGS蛋白,分别将其命名为RgsA、RgsB、RgsC、RgsD、RgsE和FlbA。这6个RGS蛋白均包含保守的RGS结构域,而RgsB、RgsC和RgsD都含有跨膜结构域。通过Northern blot分析发现,这6个基因在不同生长发育阶段的表达情况不同,说明其在不同的发育时期发挥的功能不同。进一步通过基因敲除研究其功能发现,rgsA、rgsC和rgsE参与了营养生长和菌核发育的调控;rgsA的敲除导致毒素合成增加,而rgsC和rgsE敲除则抑制了毒素的合成。rgsB和rgsD基因的敲除没有造成明显的表型缺陷,而flbA的敲除导致黄曲霉无法形成孢子、菌核和毒素。同时发现,rgsA和rgsC的敲除导致菌内cAMP水平和PKA酶活明显上升。进一步研究结果表明RgsA、RgsB、RgsD和FlbA能与Gα亚基FadA进行互作,并在无性繁殖和产毒上负调控Gα亚基的功能,说明RGS蛋白在黄曲霉菌中起到负调控cAMP/PKA通路的功能。G蛋白通过接收外界信号从而激活cAMP/PKA信号通路,而黄曲霉菌胞内的cAMP主要由腺苷酸环化酶合成。本研究在黄曲霉菌中鉴定到了酵母CYR1的同源蛋白AcyA,并通过同源重组的方法敲除了黄曲霉菌中的acyA基因,发现acyA的缺失严重抑制黄曲霉生长、无性发育和毒素的形成,突变体在花生种子中的致病力也明显下降。同时发现,acyA基因参与了营养信号的传导。此外,acyA基因的缺失导致黄曲霉对热胁迫和渗透压更加敏感,而增加了对氧胁迫的耐受性。同时发现acyA基因的敲除导致黄曲霉胞内cAMP浓度的下降,通过添加外源cAMP或cAMP类似物8-Bromo-cAMP可在一定程度上恢复突变体的表型,说明AcyA通过合成cAMP来参与调控黄曲霉的生长发育过程。cAMP在合成的过程中同样受到了腺苷酸环化酶相关结合蛋白Cap的调控作用,本研究在黄曲霉菌中鉴定到了酵母Srv2的同源蛋白Cap,并研究了其在黄曲霉生长发育和侵染过程中的功能。结果发现cap的缺失导致黄曲霉生长变慢、产孢、产毒以及致病性都显著下降,而菌核产量增多。而且发现,cap突变体的孢子萌发也受到了影响,其对渗透胁迫和基因组压力的耐受性降低。Cap作为一个多结构域的蛋白,在多个生物进程都发挥着作用,本研究进一步通过截短突变,深入研究了Cap蛋白中各个结构域对其功能发挥的作用,发现Cap的C端的结构域CARP对Cap蛋白功能发挥起着决定性的作用,C端CARP结构域的缺失导致Cap蛋白无法恢复正常的功能。检测Δcap菌株和cap各个结构域突变体菌内的cAMP水平和PKA酶活发现,cap基因的缺失抑制了黄曲霉菌内cAMP水平和PKA酶活,而Cap各个结构域的缺失同样导致黄曲霉菌内cAMP水平和PKA酶活的显著下降。同时,在黄曲霉菌中鉴定到一个高亲和力的磷酸二酯酶（PdeH）和低亲和力的磷酸二酯酶（PdeL）,并通过同源重组的方法分别将其编码基因在黄曲霉菌基因组中敲除,发现在黄曲霉菌中磷酸二酯酶主要由PdeH发挥功能,其在黄曲霉生长、产孢和菌核形成以及响应环境胁迫中发挥着比较重要的功能,而且其负调控黄曲霉毒素的合成。同时,为了研究PdeL和PdeH在黄曲霉菌中是否存在功能冗余,本研究构建了一个pdeL和pdeH的双敲突变体ΔpdeL/ΔpdeH,并且发现ΔpdeL/ΔpdeH突变株的表型缺陷比ΔpdeH突变株严重,说明PdeL和PdeH的功能在一定程度上存在冗余。此外,本研究通过外源cAMP和磷酸二酯酶抑制剂IBMX处理野生型黄曲霉,发现其可以诱导黄曲霉形成ΔpdeH突变株的表型;通过检测突变体菌内的cAMP水平,发现敲除pdeL和pdeH都导致菌内c AMP水平升高,尤其以双敲突变体更为显著,说明PdeL和PdeH参与了黄曲霉菌中cAMP的水解。在黄曲霉里面发现,cAMP在激活下游PKA蛋白中存在反馈抑制的现象。综上所述,cAMP/PKA通路上游及其通路中相关基因通过对黄曲霉胞内cAMP浓度及下游PKA酶活的调控,参与了黄曲霉菌生长发育、黄曲霉毒素合成代谢以及致病过程。通过对cAMP/PKA通路功能的阐明,将对黄曲霉毒素危害的早期预防和控制上提供重要的理论基础,同时也为其他微生物次生代谢调控机制研究提供理论依据。